评估光场显微镜测量数据的方法和用于光场显微术的设备技术

本发明专利技术涉及评估光场显微镜测量数据的方法和用于光场显微术的设备。该方法执行如下步骤：a)在样品中选择至少一个待分析的样品定位；b)利用光场显微镜，按记录时间点的序列来记录样品的图像，所述图像分别包括子图像的组；c)在步骤b)中记录的图像的子图像中确定与选择的样品定位相对应的定位；d)至少从所述子图像中的若干子图像中在子步骤c)中所确定的定位处提取出图像信号；e)针对特定的记录时间点得到积分信号，其方式是，将在步骤d)中针对确定的定位从该记录时间点的子图像中提取出的图像信号积分成积分信号；f)得到积分信号的时间曲线，其方式是，针对多个记录时间点执行步骤e)。步骤e)。步骤e)。

【技术实现步骤摘要】
评估光场显微镜测量数据的方法和用于光场显微术的设备


[0001]在第一方面，本专利技术涉及评估光场显微镜测量数据的方法。在第二方面，本专利技术涉及根据权利要求23的前序部分所述的用于光场显微术的设备。

技术介绍

[0002]类属的用于光场显微术的设备至少包含如下部件：光场显微镜，该光场显微镜具有用于发出激发光的光源；带有至少一个显微镜物镜的用于将激发光引导到样品上或引导到样品中的照明光路；用于探测由样品辐射出的光的二维空间分辨式检测器；带有至少一个微透镜阵列的用于将由样品辐射出的光引导到检测器上的检测光路；和控制和评估单元，该控制和评估单元用于操控光源和检测器并且用于评估由检测器得到的测量数据。
[0003]在生物医学研究中，越来越多地研究器官、组织和生物体中的过程。在这种情况下，例如对刺激所做出的神经反应或者颤动在肌肉组织中的传播令人感兴趣。在此，主要需要的不是具有最佳分辨率的结构方面的研究，而是更确切地说需要对三维图像数据的快速获取。接着，在这些图像数据中测量荧光信号的时间和/或空间上的相对变化，即，
[0004]ΔF/F0[0005]其中，F0是在第一时间点或者在第一空间点处测量的强度，并且ΔF是从第一时间点到第二时间点或者从第一空间点到第二空间点的信号变化。原本的图像仍然只是数据源并且通常不用于进一步的分析。由于例如神经结构在快速的体积记录(Volumenaufnahme)期间基本上保持位置固定，所以当例如在测量开始或该测量的另一时间点进行对结构的记录时，可以给该神经结构的特定区域配属快速的时间信息。
[0006]为了快速的图像记录，越来越多地使用光场显微术(LFM)。光场显微术具有如下优点：根据通常在几分之一秒内进行的唯一的相机记录，可以重建具有几十至几百微米的体积(Volumen)。在光场显微术的情况下，能够实现不同的实施方式。在所谓的位置空间光场显微术的情况下，在检测光路中在与对象平面共轭的平面内布置有微透镜阵列(MLA)。接着，在该微透镜阵列的后焦平面中使用相机传感器进行检测，该后焦平面与显微镜物镜的后焦平面(BFP，back focal plane)光学共轭。
[0007]一种对于显微术而言更直观的方法是所谓的傅里叶光场显微术，其中，微透镜阵列(MLA)布置在与物镜的光瞳平面共轭的平面内。在微透镜阵列的后焦平面(BFP)中又进行检测。在这种情况下，采集样品体积的真实成像作为在所记录的相机图像内的子图像，但是这些子图像分别属于朝着样品的不同的视差观察方向。由于视差，在对象空间中的发光的荧光分子的(假想的)轴向偏移造成信号依赖于分别进行观察的微透镜的定位地在相机传感器上横向偏移。
[0008]为了根据原始数据重建结构体积信息，提供了不同的算法。第一种算法首先将来自相机图像的所有子图像数据分离成图像堆栈，其中，该堆栈的每个子图像都对应于朝着样品的一个观察方向。现在，为了计算特定的轴向样品平面的图像内容，使该堆栈的每个子图像都移动了对于所选择的轴向平面而言所期望的视差偏移。然后，如此生成的堆栈被累
加成z平面的图像。为了获得也被称为3D堆栈的三维图像，该方法针对其它平面被重复并根据各个z平面的图像来组合成三维图像。也被称为移动求和法(Shift&Sum
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Verfahren，S&S)的该方法的缺点在于：细节信息尤其是在样品密集的情况下可能被背景严重覆盖。
[0009]另一种方法使用联合反卷积法(jDCV)。为此，需要了解针对每个微透镜的点分布函数(PSF)，并且计算时间明显比移动求和法更长。为此，得到了对比度明显更高的图像。然而，该方法的缺点在于：由于其非线性特性而可能无法保持强度比。
[0010]移动求和法和jDCV法都用于提供三维图像信息和样品的尽可能良好的结构成像。

技术实现思路

[0011]本专利技术的任务可以被视为提供如下方法和设备：该方法和该设备能够实现以高时间分辨率和良好的信噪比对局部动态过程的研究。
[0012]该任务通过具有权利要求1的特征的方法以及通过具有权利要求23的特征的设备来解决。
[0013]接下来，尤其是结合从属权利要求和附图来阐述按照本专利技术的方法的有利的变体和按照本专利技术的设备的优选的设计方案。
[0014]在按照本专利技术的评估光场显微镜测量数据的方法中，执行如下方法步骤：
[0015]a)在样品中选择至少一个待分析的样品定位；
[0016]b)利用光场显微镜，按记录时间点的序列来记录样品的图像，这些图像分别包括子图像的组；
[0017]c)在步骤b)中记录的图像的子图像中确定与所选择的样品定位相对应的定位；
[0018]d)至少从这些子图像中的若干子图像中在子步骤c)中所确定的定位处提取出图像信号；
[0019]e)针对特定的记录时间点得到积分信号，其方式是，将在步骤d)中针对确定的定位从该记录时间点的子图像中提取出的图像信号积分成积分信号；并且
[0020]f)得到该积分信号的时间曲线，其方式是，针对多个记录时间点执行步骤e)。
[0021]按照本专利技术，上文说明的类型的用于光场显微术的设备通过如下方式来改进：控制和评估单元被设立成：
[0022]A)操控光源和检测器来按记录时间点的序列记录样品的图像，其中，这些图像分别包括子图像的组；
[0023]B)在步骤A)中记录的图像的子图像中确定与由用户或以机器方式在样品中选择的样品定位相对应的定位；
[0024]C)至少从这些子图像中的若干子图像中在子步骤B)中所确定的定位处提取出图像信号；
[0025]D)针对特定的记录时间点生成积分信号，其方式是，对在步骤C)中针对确定的定位从该记录时间点的子图像中提取出的图像信号积分；以及
[0026]E)针对多个记录时间点执行步骤D)。
[0027]原则上，按照本专利技术的方法和按照本专利技术的设备适用于任何类型的样品，这些样品能利用光场显微术来研究，并且在其中应以高时间分辨率和良好的信噪比来研究动态过程。本专利技术主要适用于研究生物样品、尤其是活体样品中的生理过程。例如可以考虑沿着轨
迹、例如神经通路的样品定位。例如可以研究激发是如何沿着神经通路传播的。也可以研究细胞颗粒的运动。这种过程也称为功能跟踪。按照本专利技术的方法和按照本专利技术的设备例如也特别适合于研究钙瞬变。
[0028]在按照本专利技术的方法中，优选评估二维空间分辨式检测器的原始数据。由此，能够实现高时间分辨率。
[0029]本专利技术的重要认知可以在于：对于以高时间分辨率和良好的信噪比来研究动态过程而言，不需要完全重建光场显微镜的图像，并且更确切地说，仅对感兴趣的定位处的光场显微镜的数据进行评估就足够了。
[0030]由于在本专利技术中可以直接从原始数据中提取出重要数据，所以实现了如下重要优点：与移动求和法相比达到了更好的对比度并且与联合反卷积法相比显著节省了时间。此外，显著的优点是：以未经处理的原始数据为基础。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.评估光场显微镜测量数据的方法，其中，执行如下步骤：a)在样品(5)中选择至少一个待分析的样品定位；b)利用光场显微镜(100)，按记录时间点的序列来记录所述样品(5)的图像(200)，所述图像分别包括子图像(201、......、289)的组；c)在步骤b)中记录的图像(200)的子图像(201、......、289)中确定与选择的样品定位相对应的定位(a)；d)至少从所述子图像中的若干子图像(p1、p2、p3、p8、p9)中在子步骤c)中所确定的定位(a)处提取出图像信号；e)针对特定的记录时间点得到积分信号，其方式是，将在步骤d)中针对确定的定位(a)从该记录时间点的子图像提取出的图像信号积分成所述积分信号；并且f)得到所述积分信号的时间曲线，其方式是，针对多个记录时间点执行步骤e)。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一个待分析的样品定位由用户从所述样品(5)的概览图像、尤其是已经存在的、尤其是二维或三维的概览图像中选择；依据以目镜对所述样品的观察来选择；和/或依据以EDOF方法或具有大焦深的物镜获得的2D图像来选择。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，利用激光扫描显微镜来获得所述样品(5)的概览图像。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，利用所述光场显微镜(100)、尤其是通过对利用所述光场显微镜(100)得到的子图像(201、......、289)的组(200)的重建来获得所述样品(5)的概览图像。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，利用反卷积算法在使用所述光场显微镜(100)的多透镜阵列(9)的微透镜的点分布函数的情况下来获得三维概览图像的重建。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，通过单独计算各个轴向样品平面的图像内容来获得三维概览图像的重建，其中，计算特定的轴向样品平面的图像内容，其方式是，使在子图像(201、......、289)的组中的每个子图像都移动了对于轴向样品平面而言所期望的视差偏移，并且其中，将被移动的子图像的组累加，并且使三维概览图像由各个轴向样品平面的图像内容组合而成。7.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，计算在光场数据的子图像中的与在三维概览图像中选择的且待分析的样品定位相对应的定位。8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，分别在多个定位(a)处按照步骤a)至f)来评估记录时间点的序列的图像(200)。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤a)中在三维概览图像中由用户来选择和/或部分自动地或者完全自动地通过评估单元(12)来选择所述待分析的样品定位。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，由用户选择的样品定位与子图像(201、......、289)的组一起被转交给卷积神经网络(CNN)，所述卷积神经网络在所述方法的随后的实施中向用户建议对待分析的样品定位的预选。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于，以机器方式分析三维概览
图像的图像数据和/或所述光场显微镜(100)的图像(200)的图像数据并且在其中寻找感兴趣的结构。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于，为了进行图像评估而使用自动将图像信号配属给特定的结构特征的算法。13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其特征在于，由用户来选择和/或通过评估单元(12)自动地选择那些在子步骤c)中所确定的定位(a)处被提取出图像信号的子图像(p1、p2、p3、p8、p9)。14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其特征在于，为了选择在子步骤c)中所确定的定位(a)处被提取出图像信号的子图像(p1、p2、p3、p8、p9)，部分地或完全地以图形方式呈现所述样品(5)的利用所述光场显微镜(100)记录的图像(200)的子图像(201、......、289)的组。15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，在所述子图像的图形呈现、尤其是所述子图像的片段(p1、......、p9)的图形呈现中，通过用户、尤其是通过分割算法辅助地或者...

【专利技术属性】
技术研发人员：丹尼尔，
申请(专利权)人：卡尔蔡司显微镜有限责任公司，
类型：发明
国别省市：