快速制备标记的葡糖基胺和分析生产所述标记的葡糖基胺的糖基化生物分子的方法技术

本发明专利技术涉及快速制备标记的葡糖基胺和分析生产所述标记的葡糖基胺的糖基化生物分子的方法。分析糖基化生物分子的方法包括生产通过天然或合成酶或化学技术去糖基化的生物分子去糖基化混合物；提供具有在极性非质子、非

【技术实现步骤摘要】
快速制备标记的葡糖基胺和分析生产所述标记的葡糖基胺的糖基化生物分子的方法
[0001]本申请是申请日为2015年10月28日，申请号为201580071764.2，专利技术名称为“快速制备标记的葡糖基胺和分析生产所述标记的葡糖基胺的糖基化生物分子的方法”的专利技术专利申请的分案申请。相关申请的交叉参照
[0002]本申请要求2014年10月30日提交的美国临时申请号62/072,747和2015年1月26日提交的美国临时申请号62/107,994的优先权，其全文通过引用结合到本文中。
[0003]背景
[0004]分析来自生物源的化合物的方法常常包括衍生化步骤，以在色谱分离后引进有利于检测的荧光团。虽然存在不同的衍生化策略，但长处理时间是一个有效地采用一旦获得的分析数据的严重因素。最近已开发出减少前置时间(lead time)的试剂和相关方法，特别是关于具有胺或氨基的化合物的分析。然而伯胺和羟基之间的期望的反应选择性常常不能实现。进而，标记化合物的得率则不能优化。此外，现有技术方法频繁地生成“过度标记的”化合物。而且，标记的(labeled)或加标签的(tagged)化合物在高有机溶剂中的溶解性可能是低的，这阻碍下游固相提取程序(“SPE”)，尤其是基于亲水相互作用色谱的那些。同样，现有技术分析通常需要化合物从生物源分离和/或在衍生化之前经历洗涤步骤，这产生额外的步骤并减慢分析程序。
[0005]因此，存在对分析化合物的方法的需求，其中衍生化步骤以高得率生产被选择性地标记的加标签化合物，且不引起生物样品的降解或过度r/>‑
标记，以在标记化合物的随后的分析期间提供高的分辨率。
[0006]专利技术概述
[0007]一种分析糖基化生物分子的方法，其包括以下步骤：(a)生产去糖基化混合物，其中糖基化生物分子已通过天然或合成酶或化学技术去糖基化；(b)提供包含在极性非质子、非
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亲核有机溶剂中的标记试剂的试剂溶液；(c)在反应混合物中，以约2.5∶约1的体积比混合去糖基化混合物与试剂溶液；和(d)检测衍生的葡糖基胺。反应混合物含有相对于可修饰的胺的范围从约10
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约2000的量的摩尔过量的标记试剂，并可包括释放的葡糖基胺、蛋白质性胺和衍生的葡糖基胺。所述步骤可有目的地进行，而不损耗蛋白质物质。然后衍生的葡糖基胺可用在线或离线SPE和/或其它分离方法从反应混合物分离，或不从反应混合物分离。任选地，猝灭溶液可加入到反应混合物中，以致反应混合物的pH移至高于10。衍生的葡糖基胺的得率可以是反应混合物的约80
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约100摩尔％的量。衍生的葡糖基胺然后从反应混合物分离并通过色谱检测、荧光检测、质谱(“MS”)或紫外光(“UV”)检测和/或其组合检测。在一些实施方案中，所述方法还可包括使糖基化生物分子与酶接触以生产去糖基化混合物的步骤，或可通过其它酶或化学技术去糖基化。
[0008]在另一方面，葡糖基胺的快速衍生的方法也在本文中描述。在一些实施方案中，葡糖基胺的快速衍生的方法包括以下步骤：(1)提供生物样品；(2)合并生物样品与肽N
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糖苷酶F以生产去糖基化混合物；(3)提供包含与无水二甲基甲酰胺(DMF)合并的标记试剂的试剂溶液；和(4)混合去糖基化混合物与试剂溶液，以生产包含标记试剂、释放的葡糖基胺、蛋
白质性胺和衍生的葡糖基胺的反应混合物。所述反应混合物可具有相对于可修饰胺的约10
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约1000的量的摩尔过量的标记试剂。对于一些实施方案，摩尔过量的其它范围也在本文中描述。
[0009]在所述方法中，有机溶剂在反应混合物中的浓度可以是约0
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约50％。在一些实施方案中，有机溶剂在反应混合物中的范围可以是约10
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约40％。在一些示例性实施方案中，有机溶剂在反应混合物中的范围可以是约20％
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约30％体积。去糖基化混合物与试剂溶液以约9∶1
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约1∶9的体积比混合。在示例性实施方案中，去糖基化混合物与试剂溶液以约2.5∶约1的体积比混合，以产生具有约25
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约30％的试剂溶液的反应混合物。在一些实施方案中，试剂溶液在反应混合物中的量是28.6％。试剂溶液可以是处于维持在约环境温度或少于环境温度
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约4℃的温度下。缓冲溶液可加入去糖基化混合物中。缓冲溶液可以是磷酸钠或HEPES。或者，生物样品可以在缓冲溶液，例如HEPES中去糖基化，以用更少的步骤促进随后的衍生化反应。
[0010]任选地，猝灭溶液可加入到反应混合物中。猝灭溶液可包含乙二胺。乙二胺∶水∶乙腈的比例可以是约5∶约5∶约90体积。然后可在去糖基化混合物与试剂溶液混合后约2
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约10分钟，将猝灭溶液加入到反应混合物中。反应混合物的pH可移至约大于10。
[0011]一般地，为制备供分析的糖基化生物分子，它可以被合成地或者天然地去糖基化。更特别地，为制备标记的N
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聚糖，生物样品可具有糖基化生物分子例如糖蛋白，其可以用肽N
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糖苷酶F(PNGase F)去糖基化，生产去糖基化混合物。标记试剂可以在无水二甲基甲酰胺(DMF)和/或其它极性非质子非
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亲核有机溶剂中合并，以生产试剂溶液。去糖基化混合物和试剂溶液随后以约2.5∶约1的体积比(2.5∶1v/v/v)混合，以生产反应混合物，且葡糖基胺可以用标记试剂快速地标记。衍生的葡糖基胺可以经历色谱分析、质谱、紫外光和/或荧光检测。
[0012]在此描述的快速标记葡糖基胺的方法可包括可选择类型的分离和检测方法。分离技术可包括，但不限于，亲水相互作用色谱(“HILIC”)、固相提取(“SPE”)、毛细管电泳、高pH阴离子交换色谱或反相液相色谱。检测方法可包括色谱检测例如高压液相色谱(“HPLC”)、超高效液相色谱(UHPLC)、超临界流体色谱、紫外光(“UV”)检测、荧光检测、基质辅助激光解吸离子化质谱、电喷雾离子化质谱和/或脉冲安培检测。
[0013]附图简述
[0014]图1是显示在此描述的方法的步骤的流程图。
[0015]图2是显示温度对氨基
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标记的基团的得率和对胺和缓激肽的羟基之间的反应选择性的影响的图。
[0016]图3A和3B各自是显示有机溶剂(分别为DMSO和DMF)和有机溶剂浓度对氨基
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标记的基团的得率和对胺和缓激肽的羟基之间的反应选择性的影响的图。
[0017]图4A和4B是显示缓冲液(分别为200mM硼酸钠、200mM磷酸钠)对氨基
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标记的基团的得率的影响的图。图4C显示当200mM硼酸钠和200mM磷酸钠缓冲液用于反应混合物中时，在羟基上修饰的葡糖基胺的％。
[0018]图5A和5B是显示缓冲液浓度和离子强度对氨基
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标记和羟基的得率和对胺和缓激肽的羟基之间的反应选择性的影响的图。图5A显示本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种糖基胺的快速衍生化的方法，其包括以下步骤：提供包含糖蛋白的生物样品；使糖蛋白与酶接触以产生去糖基化混合物；和混合：(a)包含与极性非质子、非
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亲核有机溶剂合并的、选自N
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羟基琥珀酰亚胺酯试剂和N
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羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯试剂的标记试剂的试剂溶液，(b)去糖基化混合物，和(c)缓冲溶液，以产生反应混合物，所述反应混合物在其中蛋白质物质尚未被从去糖基化混合物耗尽的条件下形成，所述反应混合物包含摩尔过量的标记试剂，所述反应混合物具有标记试剂、释放的糖基胺、含赖氨酸残基的蛋白质性胺和衍生的糖基胺，其中衍生的糖基胺的得率是约80
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约100%，且具有少于0.2摩尔%的量的糖基胺的过量标记。2.权利要求1的方法，其还包括通过在线固相提取来分离衍生的糖基胺的步骤。3.权利要求1的方法，其中极性非质子、非
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亲核有机溶剂选自DMF、DMSO和乙腈。4.权利要求3的方法，其中反应混合物中的DMF浓度是少于约20%
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约30%体积或反应混合物中的DMSO的浓度是少于约30%
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约50%。5.权利要求1的方法，其中去糖基化混合物与试剂溶液以约2.5:约1的体积比混合。6.权利要求1的方法，其中试剂溶液具有维持在约环境温度的温度。7.权利要求1的方法，其还包括加入猝灭溶液至反应混合物中，其中猝灭溶液包含乙二胺和反应混合物的pH移至大于约10。8.权利要求7的方法，其中乙二胺:水:乙腈的比例是约5:约5:约90体积。9.权利要求7的方法，其中在去糖基化混合物与试剂溶液混合后约2
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约10分钟，猝灭溶液被加入到反应混合物中。10.权利要求1的方法，其中在进行另外的样品处理之前，允许标记进行30秒
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10分钟。11.权利要求1的方法，其中酶是肽N
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糖苷酶F。12.权利要求10的方法，其中缓冲溶液包含HEPES或磷酸钠。13.权利要求12的方法，其中缓冲溶液具有约7...

【专利技术属性】
技术研发人员：MA劳伯，DW布劳斯米歇，SM科扎，
申请(专利权)人：沃特世科技公司，
类型：发明
国别省市：