一种胡枝子玻璃化法超低温保存的方法技术

本发明专利技术公开了一种胡枝子玻璃化法超低温保存的方法，属于超低温保存技术领域。本发明专利技术的制备方法为(1)冻藏，包括预培养、冷冻保护和冷冻；(2)解冻，包括水浴化冻、洗涤和恢复培养。本发明专利技术玻璃化冷冻保存后胡枝子的成活率达到90％以上，多次玻璃化冷冻保存后基因突变点个数小于2，遗传稳定性较高。遗传稳定性较高。

【技术实现步骤摘要】
一种胡枝子玻璃化法超低温保存的方法


[0001]本专利技术属于超低温保存
，具体涉及一种胡枝子玻璃化法超低温保存的方法。

技术介绍

[0002]植物种质资源作为一种可再生资源，是人类赖以生存的自然资源之一。近些年，随着自然资源、生态环境的破坏以及新品种、杂交种的推广，种质资源流失越来越严重，受到灭绝威胁的植物占总数的12％～15％。因此，保存植物种质资源已经刻不容缓。1989年Uragami等和Langis等首次报道玻璃化法保存在植物中的应用，证实了应用玻璃化法冻存植物种质材料的可行性。玻璃化法超低温保存为植物种质资源有用基因的长期利用和保护提供一条有效途径。
[0003]PVS2是玻璃化法超低温保存常用和最佳的冷冻保护液，但PVS2会对细胞造成非生物胁迫和化学毒害，会导致植物多次继代培养后变异率增加。因此，如何提高多次继代培养后的遗传稳定性，是玻璃化法超低温保存亟需解决的技术问题。

技术实现思路

[0004]为解决现有技术中的上述问题，本专利技术提供了一种胡枝子玻璃化法超低温保存的方法。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种胡枝子玻璃化法超低温保存的方法，包括以下步骤：
[0007](1)冻藏
[0008]1.1将胡枝子萌发芽置于培养基A中预培养；
[0009]1.2将步骤1.1预培养后的胡枝子萌发芽置于PVS2+植物提取液复合冷冻保存剂中冷冻保存；
[0010]1.3将步骤1.2冷冻保存后的胡枝子萌发芽置于液氮中冷冻；
[0011](2)解冻
[0012]2.1将步骤(1)冻藏的胡枝子萌发芽水浴化冻；
[0013]2.2将步骤2.1化冻后的胡枝子萌发芽用培养液B洗涤；
[0014]2.3将步骤2.2洗涤后的胡枝子萌发芽置于培养基C中恢复培养。
[0015]进一步地，步骤1.1中，所述胡枝子萌发芽为外植体经脱分化形成愈伤组织后第一次继代培养的萌发芽。
[0016]进一步地，步骤1.1中，所述培养基A为0.5mol/L蔗糖浓度的MS培养基。
[0017]进一步地，步骤1.1中，所述预培养时间为3～5d。
[0018]进一步地，步骤1.2中，所述植物提取液的提取方法为：将经低温+CO2胁迫培养的苜蓿全株置于0.05mol/L，pH＝7.8的磷酸缓冲液中，冰浴研磨为均浆，之后将研磨得到的均浆离心分离，上清液即所述植物提取液。
[0019]更进一步地，所述低温+CO2胁迫培养的具体步骤为：将苜蓿幼苗栽种于培养容器中，定植10～15d后置于密闭培养箱中，控制密闭培养箱的温度为
‑
5～0℃，CO2的浓度为1000～1500mg/L，在光照强度为300～500lx下培养3～5h。
[0020]更进一步地，所述0.05mol/L，pH＝7.8的磷酸缓冲液的制备方法为将228.75mL 0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液与21.25mL 0.2mol/L的磷酸二氢钠溶液混合，之后用蒸馏水定容至1000mL。
[0021]更进一步地，所述苜蓿全株与磷酸缓冲液的质量体积比为1g：(10～20)mL；所述离心分离的温度为4℃，时间为20～40min。
[0022]进一步地，步骤1.2中，所述PVS2为100％PVS2，所述PVS2与植物提取液的体积比为(3～5)：1；所述冷冻保护的温度为10～20℃，时间为1～3h。
[0023]进一步地，在进行冷冻保护前，将胡枝子萌发芽置于60％PVS2中，在温度为23～27℃下预处理2～5min。
[0024]进一步地，步骤1.3中，所述冷冻的时间为48～70h。
[0025]进一步地，步骤2.1中，所述水浴化冻的水温为50～60℃，时间为2～3min。
[0026]进一步地，步骤2.2中，所述培养液B为1.2mol/L蔗糖浓度的MS培养液，洗涤时间为30～50min。
[0027]进一步地，所述培养基C为MS+0.6～1mg/L BA+0.05～0.25mg/L NAA+0.2～0.4mg/LIBA+20～40g/L蔗糖+4～7g/L琼脂。
[0028]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0029](1)本专利技术玻璃化冷冻保存后胡枝子的成活率达到90％以上，多次玻璃化冷冻保存后胡枝子的遗传稳定性较高，十二次玻璃化冷冻保存后，基因突变点个数小于2；
[0030](2)本专利技术利用低温和二氧化碳协同胁迫植株产生多种生物酶，在低温条件下将生物酶提取并与PVS2以一定比例混合，利用生物酶与PVS2共同作用，在利用PVS2对胡枝子进行低温保护的同时利用生物酶保护胡枝子萌发芽细胞的细胞膜和细胞壁，减少PVS2对胡枝子萌发芽的非生物胁迫和细胞毒害，从而提高了成活率以及遗传稳定性。
具体实施方式
[0031]现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。
[0032]另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0033]除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
[0034]在不背离本专利技术的范围或精神的情况下，可对本专利技术说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本专利技术的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本专利技术说明书和实施例仅是示例性的。
[0035]关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
[0036]以下实施例中，所述胡枝子萌发芽为外植体经脱分化形成愈伤组织后第一次继代培养的萌发芽。
[0037]以下实施例中，所述0.05mol/L，pH＝7.8的磷酸缓冲液的配制为：将228.75mL 0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液与21.25mL 0.2mol/L的磷酸二氢钠溶液混合，之后用蒸馏水定容至1000mL。
[0038]实施例1
[0039](1)植物提取液的制备
[0040]1.1将生长至2cm的苜蓿幼苗栽种于塑料盆中，每棵幼苗间隔15cm，定植培养10d，之后将塑料盆置于密闭培养箱中，其中，培养箱的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种胡枝子玻璃化法超低温保存的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)冻藏1.1将胡枝子萌发芽置于培养基A中预培养；1.2将步骤1.1预培养后的胡枝子萌发芽置于PVS2+植物提取液复合冷冻保护剂中冷冻保护；1.3将步骤1.2冷冻保护后的胡枝子萌发芽置于液氮中冷冻；(2)解冻2.1将步骤(1)冻藏的胡枝子萌发芽水浴化冻；2.2将步骤2.1化冻后的胡枝子萌发芽用培养液B洗涤；2.3将步骤2.2洗涤后的胡枝子萌发芽置于培养基C中恢复培养。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1.1中，所述胡枝子萌发芽为外植体经脱分化形成愈伤组织后第一次继代培养的萌发芽；所述培养基A为0.5mol/L蔗糖浓度的MS培养基；预培养时间为3～5d。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1.2中，所述植物提取液的提取方法为：将经低温+CO2胁迫培养的苜蓿全株置于0.05mol/L，pH＝7.8的磷酸缓冲液中，冰浴研磨为均浆，之后将研磨得到的均浆离心分离，上清液即所述植物提取液。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述低温+CO2胁迫培养的具体步骤为：将苜蓿幼苗栽种于培养容器中，定植10～15d后置于密闭培养箱中，控制密闭培养箱的温度为
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5～0℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹明华，欧阳克蕙，蒋晓峰，龚琼，林国卫，林弘，
申请(专利权)人：上饶师范学院，
类型：发明
国别省市：