分离培养牛种布鲁氏菌的方法技术

本发明专利技术提供一种分离培养牛种布鲁氏菌的方法。该方法涉及选择性双相培养瓶或选择性需氧血培养瓶，培养基组分包括酪蛋白胰酶消化物、大豆木瓜蛋白酶水解物、氯化钠、葡萄糖、磷酸氢二钾、聚茴香脑磺酸钠、盐酸吡哆醇、复合维生素、琼脂、柠檬酸和黄芩素等。本发明专利技术通过制作选择性双相培养瓶和选择性需氧血培养瓶，选择性培养疑似布鲁氏菌菌落的牛种布鲁氏菌，操作简单，无需较高的专业技能，通过观察菌落的有无即可判断是否为牛种布鲁氏菌感染，可应用于布鲁氏菌种型鉴定涉及的研究等，切实为我国布病防控提供技术保障。病防控提供技术保障。

【技术实现步骤摘要】
分离培养牛种布鲁氏菌的方法


[0001]本专利技术涉及微生物培养
，具体地说，涉及一种分离培养牛种布鲁氏菌的方法。

技术介绍

[0002]布鲁氏菌(Brucella)能够引起全球人畜共患流行病—布鲁氏菌病(简称布病)。近年来，布病的发病率逐年增高，已经严重影响公共卫生安全及经济发展。目前，布鲁氏菌已经被发现有12个种，常见引起人间布病感染的布鲁氏菌主要是羊种(B.melitensis)、牛种(B.abortus)、猪种(B.suis)和犬种(B.canis)。布病的感染人群主要为农牧民、兽医、屠宰工，特别是畜牧业发达的省市及自治区等感染和发病率较高。
[0003]布鲁氏菌的分离培养是布病诊断的金标准。现阶段，在获得疑似菌落后，研究人员需要利用传统的生化表型方法(包括CO2的需求试验、H2S试验、单项特异性血清凝集试验、染料抑菌试验以及噬菌体裂解试验等)和分子生物学方法(包括PCR、MLVA、MLST、RT
‑
PCR等)鉴定布鲁氏菌的种型，耗时长，成本高，需要较高的专业技能，且对实验条件要求较高。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种分离培养牛种布鲁氏菌的方法。
[0005]本专利技术构思如下：专利技术人利用牛种、羊种、猪种和犬种布鲁氏菌筛选2000多种小分子药物发现牛种布鲁氏菌对部分小分子药物存在抗性，通过对牛种8个亚型(1、2、3、4、5、6、7、9型)、羊种3个亚型(1、2、3型)、猪种5个亚型(1、2、3、4、5型)和犬种1个亚型的再次试验，确认牛种布鲁氏菌对部分小分子药物存在抗性。根据部分小分子药物制作牛种布鲁氏菌选择性双相培养瓶和选择性需氧血培养瓶，结合普通双相培养瓶和需氧血培养瓶的结果，可以判断是否为牛种布鲁氏菌感染。
[0006]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种组合物在制备用于分离培养牛种布鲁氏菌的培养基中的应用，所述组合物由柠檬酸和黄芩素组成，各成分在培养基中的含量分别为：柠檬酸8
‑
256ng/L和黄芩素16
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256ng/L。
[0007]第二方面，本专利技术提供一种选择性双相培养基，由固体培养基和液体培养基两部分组成；
[0008]其中，所述固体培养基包含酪蛋白胰酶消化物15g/L、大豆木瓜蛋白酶水解物5g/L、氯化钠5g/L、柠檬酸8
‑
256ng/L、黄芩素16
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256ng/L、琼脂15g/L。
[0009]所述液体培养基包含酪蛋白胰酶消化物15g/L、大豆木瓜蛋白酶水解物3g/L、氯化钠5g/L、葡萄糖2.5g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、柠檬酸8
‑
256ng/L、黄芩素16
‑
256ng/L、聚茴香脑磺酸钠(SPS)35mg/L和复合维生素5mg/L。
[0010]第三方面，本专利技术提供所述选择性双相培养基的制备方法，包括以下步骤：
[0011]A、制备固体培养基：称取酪蛋白胰酶消化物15g、大豆木瓜蛋白酶水解物5g、氯化钠5g、琼脂15g，用1L去离子水加热溶解后，分装20
‑
30mL置于双相培养瓶中，121℃高压灭菌
15
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20min；称取柠檬酸和黄芩素，用DMSO溶解，使其浓度分别80
‑
2560mg/L和160
‑
2560mg/L，过滤除菌后各取100μL加入冷却至约50℃未凝固的培养基中，混匀后平置至冷却凝固；
[0012]B、制备液体培养基：称取酪蛋白胰酶消化物15g、大豆木瓜蛋白酶水解物3g、氯化钠5g、磷酸氢二钾2.5g，用1L去离子水溶解后121℃高压灭菌15
‑
20min，得到溶液I；称取柠檬酸和黄芩素，用DMSO溶解，使其浓度分别为80
‑
2560mg/L和160
‑
2560mg/L，称取葡萄糖、聚茴香脑磺酸钠、复合维生素用去离子水溶解，使其浓度分别为250g/L、35g/L、5g/L，过滤除菌后加入所述溶液中，使其终浓度分别为柠檬酸8
‑
256ng/L、黄芩素16
‑
256ng/L、葡萄糖2.5g/L、SPS 35mg/L和复合维生素5mg/L，即为液体培养基，添加到步骤A的含有固体培养基的双相培养瓶中，每瓶双相培养瓶中分装25
‑
30mL。
[0013]第四方面，本专利技术提供所述选择性双相培养基在分离培养牛种布鲁氏菌中的应用(含非疾病诊断目的)。
[0014]第五方面，本专利技术提供一种分离培养牛种布鲁氏菌的方法(含非疾病诊断目的)，包括以下步骤：
[0015](1)将待测液体样本分成两等份，一份注入选择性双相培养瓶中，另一份注入普通双相培养瓶中，将双相培养瓶放入37℃5
‑
10％ CO2培养箱中培养，液相充分浸润固相4
‑
12h后倾斜培养；
[0016]其中，所述选择性双相培养瓶装有所述选择性双相培养基；
[0017]所述普通双相培养瓶装有普通双相培养基，所述普通双相培养基不含有本专利技术所述的组合物；
[0018](2)培养1
‑
4周(优选培养1
‑
2周)后，观察培养结果：
[0019]有细菌感染的情况：
[0020]a.双相培养瓶中可见液相部分浑浊，固相部分可见单菌落生长；
[0021]b.若单菌落呈圆形，直径1
‑
2mm，边缘光滑，菌落呈光泽、半透明的浅黄色，此为疑似布鲁氏菌；
[0022]c.若选择性双相培养瓶及普通双相培养瓶中均有此单菌落生长，则为牛种布鲁氏菌；若选择性双相培养瓶无此单菌落生长而普通双相培养瓶有此单菌落生长，则为羊种、猪种或犬种布鲁氏菌；若选择性双相培养瓶有此单菌落生长而普通双相培养瓶无此单菌落生长，则试验失败，需重复进行验证。
[0023]无细菌感染的情况：若选择性双相培养基及普通培养基均液相部分清澈，固相部分无单菌落或菌苔生长，则样品中未有细菌感染；
[0024]第六方面，本专利技术提供一种选择性需氧血培养基，所述选择性需氧血培养基是包含酪蛋白胰酶消化物17g/L、大豆木瓜蛋白酶水解物3g/L、聚茴香脑磺酸钠35mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、柠檬酸8
‑
256ng/L、黄芩素16
‑
256ng/L、氨基酸复合物5mg/L、和复合维生素5mg/L的液体培养基。
[0025]第七方面，本专利技术提供所述选择性需氧血培养基的制备方法，所述方法包括：称取酪蛋白胰酶消化物17g、大豆木瓜蛋白酶水解物3g，用1L去离子水溶解后分装于血培养瓶中，121℃高压灭菌15
‑
20min；称取氨基酸复合物、复合维生素、聚茴香脑磺酸钠、盐酸吡哆醇用去离子水溶解，过滤除菌后加入血培养瓶中，使其终浓度分别为5mg/L、5mg/L、35mg/L、1mg本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.组合物在制备用于分离培养牛种布鲁氏菌的培养基中的应用，所述组合物由柠檬酸和黄芩素组成，各成分在培养基中的含量分别为：柠檬酸8
‑
256ng/L和黄芩素16
‑
256ng/L。2.选择性双相培养基，其特征在于，由固体培养基和液体培养基两部分组成；其中，所述固体培养基包含酪蛋白胰酶消化物15g/L、大豆木瓜蛋白酶水解物5g/L、氯化钠5g/L、柠檬酸8
‑
256ng/L、黄芩素16
‑
256ng/L、琼脂15g/L；所述液体培养基包含酪蛋白胰酶消化物15g/L、大豆木瓜蛋白酶水解物3g/L、氯化钠5g/L、葡萄糖2.5g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、柠檬酸8
‑
256ng/L、黄芩素16
‑
256ng/L、聚茴香脑磺酸钠35mg/L和复合维生素5mg/L。3.权利要求2所述选择性双相培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A、制备固体培养基：称取酪蛋白胰酶消化物15g、大豆木瓜蛋白酶水解物5g、氯化钠5g、琼脂15g，用1L去离子水加热溶解后，分装20
‑
30mL置于双相培养瓶中，121℃高压灭菌15
‑
20min；称取柠檬酸和黄芩素，用DMSO溶解，使其浓度分别为80
‑
2560mg/L和160
‑
2560mg/L，过滤除菌后各取100μL加入冷却至50℃未凝固的培养基中，混匀后平置至冷却凝固；B、制备液体培养基：称取酪蛋白胰酶消化物15g、大豆木瓜蛋白酶水解物3g、氯化钠5g、磷酸氢二钾2.5g，用1L去离子水溶解后121℃高压灭菌15
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20min，得到溶液I；称取柠檬酸和黄芩素，用DMSO溶解，使其浓度分别为80
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2560mg/L和160
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2560mg/L，称取葡萄糖、聚茴香脑磺酸钠、复合维生素用去离子水溶解，使其浓度分别为250g/L、35g/L、5g/L，过滤除菌后加入所述溶液I中，使其终浓度分别为柠檬酸8
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256ng/L、黄芩素16
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256ng/L、葡萄糖2.5g/L、SPS 35mg/L和复合维生素5mg/L，即为液体培养基，添加到步骤A的含有固体培养基的双相培养瓶中，每瓶双相培养瓶中分装25
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30mL。4.权利要求2所述选择性双相培养基在分离培养牛种布鲁氏菌中的应用；所述应用为非疾病诊断目的。5.分离培养牛种布鲁氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将待测液体样本分成两等份，一份注入选择性双相培养瓶中，另一份注入普通双相培养瓶中，将双相培养瓶放入37℃5
‑
10％CO2培养箱中培养，液相充分浸润固相4
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12h后倾斜培养；其中，所述选择性双相培养瓶装有权利要求2所述的选择性双相培养基；所述普通双相培养瓶装...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晓雯，丁家波，蒋卉，李朋，梁琳，梁瑞英，范学政，沈青春，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：