一种具有免疫调节功能的枸杞多糖及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种具有免疫调节功能的枸杞多糖及其制备方法。该多糖采用80％乙醇提取去除小分子物质、Sevage法脱除蛋白以及大孔树脂脱色，经DEAE离子交换和SephacrylS

【技术实现步骤摘要】
一种具有免疫调节功能的枸杞多糖及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物医药领域，主要涉及一种具有免疫调节作用的多糖及其制备方法。

技术介绍

[0002]免疫系统是机体抵御外来病原体的重要系统，当病原微生物入侵宿主时，参与机体非特异性免疫的巨噬细胞合成并分泌趋化因子和细胞因子，增强机体抵抗力。传统中草药多糖以其多种途径、多靶点对免疫细胞具有良好的激活作用而受到广泛关注。传统中草药多糖具有可以增强巨噬细胞吞噬能力，诱导炎症因子(如肿瘤坏死因子
‑
α、白细胞介素
‑
1β、和白细胞介素
‑
6)和炎症介质(如一氧化氮)表达间接杀死病原体，从而参与免疫调节信号通路。
[0003]枸杞子是一种具有数千年使用历史的补益中药，色彩鲜艳悦目，品之香甜可口。作为一种倍受青睐的餐桌美食和滋补佳品在世界范围内广泛使用，以各种形式出现在果汁、酒、茶和各种固体食品中。多糖类资源性物质是枸杞子中最著名的生物活性成分，具有多种药用特性。与此同时，免疫调节作用是最主要的，并参与其他多种活性。然而枸杞多糖的化学结构和组成多样，细微的结构变化可能影响其免疫活性。枸杞多糖生物活性受其单糖组成、分子量、糖苷键和分支程度等多方面影响。为了探索枸杞多糖结构与免疫活性之间的关系，本专利技术对枸杞多糖精细结构进行表征及探索其免疫活性机制，为枸杞子免疫增强应用的开发提供一定的理论基础。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供一种枸杞多糖及其在免疫调节中的应用，该枸杞多糖是从枸杞子中制备得到的中性阿拉伯半乳聚糖，体外RAW264.7巨噬细胞活性试验表明，该多糖具有显著的细胞增殖能力，促进NO、TNF
‑
α和IL
‑
6等细胞因子的分泌，并激活MAPK信号通路。因此，所述枸杞多糖具有免疫调节的前景，有望用于增强免疫力的食品及保健品添加剂。
[0005]一种具有免疫调节功能的枸杞多糖(简称LFP
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80
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W1)，所述枸杞多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖构成，所述枸杞多糖的分子量为4.58
×
104Da。
[0006]作为优选方案，以上所述的具有免疫调节功能的枸杞多糖，所述枸杞多糖由含量为2.97％、44.99％、3.65％、1.06％、6.48％、40.85％的鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖构成。
[0007]本专利技术所述的具有免疫调节功能的枸杞多糖的制备方法，包括以下步骤：
[0008](1)取枸杞子，加稀乙醇提取，得到稀乙醇提取液和醇提药渣；
[0009](2)取步骤(1)醇提药渣加去离子水提取，将所得水提液进行浓缩，得到水溶性组分；
[0010](3)将所述水溶性组分，先用低浓度乙醇进行沉淀后，收集溶液部分，再用高浓度乙醇进行醇沉，收集沉淀，用乙醇洗涤后，冷冻干燥，得沉淀产物；
[0011](4)将步骤(3)沉淀产物溶于水中，先经Sevag法脱蛋白、然后采用D101大孔树脂脱色，最后使用透析袋进行透析，得透析产物，冷冻干燥；
[0012](5)将干燥产物再次溶于水中，经离子交换树脂洗脱，收集纯水洗脱组分，减压浓缩后重新溶于纯水中，上样至聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱反复分离，收集洗脱峰组分，冷冻干燥，即得。
[0013]作为优选方案，以上所述的具有免疫调节功能的枸杞多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0014](1)取枸杞子，加体积浓度70～80％的乙醇提取1～3次，得到醇提液和醇提药渣；
[0015](2)取醇提药渣加6～20倍的去离子水提取1～2次，将所得水提液进行浓缩，得到水溶性组分；
[0016](3)将所述水溶性组分，加入乙醇调整至醇体积浓度为30％，沉淀后，收集溶液部分，减压浓缩，加入乙醇，使其最终乙醇体积浓度达到80％，收集沉淀，用乙醇洗涤，冷冻干燥得沉淀产物；
[0017](4)将沉淀产物溶于水中，先经Sevage法，即体积比为3:1的三氯甲烷：正丁醇溶液进行脱蛋白、然后采用D101大孔树脂脱色，最后使用3500Da透析袋进行透析，得透析产物，冷冻干燥；
[0018](5)将步骤.(4)冷冻干燥产物再次溶于水中，经离子交换树脂洗脱，收集纯水洗脱组分，减压浓缩后重新溶于纯水中，上样至Sephacryl S
‑
100凝胶柱反复分离，收集洗脱峰组分，冷冻干燥，即得。
[0019]作为优选方案，以上所述的具有免疫调节功能的枸杞多糖的制备方法，所述的步骤(1)，取枸杞子，加体积浓度80％的乙醇回流提取或连续回流提取2～3次，每次1～2小时，得到80％的乙醇提取液和醇提药渣；
[0020]所述的步骤(2)，取醇提药渣加6～15倍的水煎煮或回流提取1～2次，每次1～2小时，将所得水提液进行浓缩，得到水溶性组分。
[0021]作为优选方案，以上所述的具有免疫调节功能的枸杞多糖的制备方法，步骤(4)中的D101大孔树脂脱色，吸附时间为20min，洗脱流速为2.4BV/h，洗脱溶剂为去离子水；使用3500Da透析袋常温透析24h，每4h更换一次透析液。
[0022]作为优选方案，以上所述的具有免疫调节功能的枸杞多糖的制备方法，步骤(5)所述的离子交换树脂型号为DEAE
‑
52，枸杞多糖吸附30min后，使用去离子水洗脱；所述的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶型号为Sephacryl S
‑
100，使用去离子水反复洗脱。
[0023]本专利技术制备得到的枸杞多糖，扫描电镜形貌特征分析为不规则的薄片状，质地松散，原子力显微镜显示所述多糖由随机线性链和少量球形聚集组成，在三维图像中具有不同高度的锥形形状。
[0024]更进一步的，所述枸杞多糖经甲基化气相质谱检测的糖醇乙酰酯峰为11个，其中
→
3,6)
‑
Galp
‑
(1
→
糖苷键含量最高。
[0025]更进一步的，所述枸杞多糖的1H
‑
NMR图谱中，位于δ4.35
‑
5.27ppm处有11个端基氢质子，
13
C
‑
NMR图谱中，δ100.68
‑
109.17ppm范围内对应11个端基碳质子。
[0026]更进一步的，所述枸杞多糖经70℃部分酸水解的寡糖图谱由15个聚合度依次增加的寡糖组成，包括两对同分异构体。
[0027]有益效果：本专利技术制备得到的枸杞多糖可促进RAW264.7细胞增殖，促进NO、IL
‑
6和TNF
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α的释放以及上调相应mRNA的表达，激活MAPK信号通路促进磷酸化p38、p
‑
ERK及p
‑
JNK蛋白水平表达。
[0028]本专利技术提供的枸杞多糖可用于免疫增强产品，包括但不限于疫苗佐剂、功能性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有免疫调节功能的枸杞多糖，其特征在于，所述枸杞多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖构成，所述枸杞多糖的分子量为4.58
×
104Da。2.根据权利要求1所述的具有免疫调节功能的枸杞多糖，其特征在于，所述枸杞多糖由质量百分含量为2.97％、44.99％、3.65％、1.06％、6.48％、40.85％的鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖构成。3.权利要求1或2所述的具有免疫调节功能的枸杞多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取枸杞子，加稀乙醇提取，得到稀乙醇提取液和醇提药渣；(2)取步骤(1)醇提药渣加水提取，将所得水提液进行浓缩，得到水溶性组分；(3)将所述水溶性组分，先用低浓度乙醇进行沉淀后，收集溶液部分，再用高浓度乙醇进行醇沉，收集沉淀，用乙醇洗涤后，冷冻干燥，得沉淀产物；(4)将步骤(3)沉淀产物溶于水中，先经Sevage法脱蛋白、然后采用D101大孔树脂脱色，最后使用透析袋进行透析，得透析产物，冷冻干燥；(5)将干燥产物再次溶于水中，经离子交换树脂洗脱，收集纯水洗脱组分，减压浓缩后重新溶于纯水中，上样至聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱反复分离，收集洗脱峰组分，冷冻干燥，即得。4.根据权利要求3所述的具有免疫调节功能的枸杞多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取枸杞子，加体积浓度70～80％的乙醇提取1～3次，得到醇提液和醇提药渣；(2)取醇提药渣加6～20倍的去离子水提取1～2次，将所得水提液进行浓缩，得到水溶性组分；(3)将所述水溶性组分，加入乙醇至醇体积浓度至30％，沉淀后，收集溶液部分，随后减压浓缩，加入乙醇，...

【专利技术属性】
技术研发人员：段金廒，郭盛，张芳，梁小飞，钱大玮，
申请(专利权)人：南京中医药大学，
类型：发明
国别省市：