一种基于自组装DNA核酸链传感器的多种肿瘤标记物化学发光快速检测方法技术

本发明专利技术提供一种基于自组装DNA核酸链传感器的多种肿瘤标记物化学发光快速检测方法，其中利用寡核酸链和适体构建自组装DNA核酸双链，在一种或多种靶目标(不同配体)的存在下，利用适体与配体的强结合力使自组装DNA核酸双链瓦解，释放出相应的单链核酸链与磁性微球载体上的互补DNA单链结合，通过磁性分离，利用不同化学发光探针进行化学发光检测相应的目标物。该自组装DNA核酸双链可以在同一个初始体系中检测多种目标物，为实际应用减少了检测时间、降低了检测成本，且该自组装DNA核酸链可以替换成其他目标物的适体链或检测两个及两个以上的目标物，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种基于自组装DNA核酸链传感器的多种肿瘤标记物化学发光快速检测方法


[0001]本专利技术涉及分析化学医学检测
，结合核酸适配体技术，具体涉及一种基于自组装DNA核酸链传感器的多种肿瘤标记物化学发光快速检测方法。

技术介绍

[0002]甲胎蛋白(Alphafetoprotein，AFP)是一种70kDa的糖蛋白，含有约4％的碳水化合物，主要由妊娠期间的胎儿肝脏产生。正常情况下，甲胎蛋白血清浓度在小孩出生后急剧下降，成年后其合成受到极大抑制。然而，70％以上肝癌患者肿瘤排泄的AFP血清浓度较高，故临床将AFP作为肝癌及其他癌症的肿瘤标志物。因此，血清AFP的早期筛查对肿瘤患者临床早期诊断及预后中起着非常重要的作用。
[0003]三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)作为细胞代谢的主要能量分子，在调节各种生命活动中起着不可替代的作用。大量研究表明，生物体中的ATP浓度与许多疾病密切相关，如低血糖、心血管疾病和一些恶性肿瘤。此外，ATP可作为细胞代谢的有效指标，实时监测一些肿瘤患者病程状况。因此，敏感、可靠地检测ATP是病理诊断的关键。
[0004]核酸适配体(Aptamer，Apt)技术在分析化学尤其是微量物质的定量检测中展现出了突出的技术优势。核酸适体是通过SELEX技术体外筛选出来的能够特异性结合目标物配体的寡核苷酸片段。其以特有的高亲和力及特异性，可作为识别探针和生物传感器，与蛋白质类抗体相比，核酸适体不仅能高效、特异性地识别和结合配体，还具有易标记、易合成、性质稳定等优势。然而想要获得可行的检测方法，建立高效且能实现多配体同时检测的适配体传感器是关键。首先，适体传感器在分子水平上应当满足实验所选择的发光体系的要求，采用何种标记物，标记物在传感器上的连接方法等都需要进行针对性设计；此外，选择何种分离载体和捕获探针可以完整收集信号物质并实现与信号物质含量有规律的发光反应，也需要根据发光体系、标记物、适体等物质的性质进行设计；除此之外，发光体系的选择关乎最终检测结果与被检测物质真实含量之间的关系，因此也是影响检测效果的重要因素。
[0005]目前临床上多采用荧光、紫外等方法检测肿瘤标记物，存在灵敏性差、应用效果不好的问题；此外还有化学发光方法(Chemiluminescence，CL)检测肿瘤标记物，但大部分只能用于单一肿瘤标记物检测，无法实现多组分同时检测，仍存在耗时长、灵敏度不够高的情况。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中的不足与难题，本专利技术旨在提供一种基于自组装DNA核酸链传感器的多种肿瘤标记物化学发光快速检测方法，适体技术巧妙结合磁性微球的“同相反应，异相分离”特点，创建了基于自组装适体及DNA核酸链化学发光生物传感器，可实现两种甚至多种肿瘤标记物的同时检测。本专利技术实现了一种基于自组装DNA核酸链传感器的多种肿瘤标记物化学发光快速检测方法，能够快速、高效地同时实现AFP和ATP检测，为医学检测提供
了新的思路，且对多组分研究测定具有重大意义，更有望进一步实现全自动大批量检测。
[0007]一种基于自组装DNA核酸链传感器的多种肿瘤标记物化学发光快速检测方法，其中涉及三磷酸腺苷适体(ATP aptamer，Apt1)、甲胎蛋白适体(AFP aptamer，Apt2)、信号DNA链1(Signal DNA 1，S1)、桥梁DNA链(Bridge
‑
DNA，B)、信号DNA链2(Signal DNA 2，S2)、与S1互补的DNA链(Capture
‑
DNA complementary to S1，C1)、与S2互补的DNA链(Capture
‑
DNA complementary to S2，C2)。其中，ATP可与Apt1特异性识别，AFP可与Apt2特异性识别，S1可与C1碱基互补配对，S2可与C2碱基互补配对，B主要用于辅助构造自组装DNA核酸链，C1、C2末端的氨基可与羧基修饰的磁性微球通过酰胺键结合。过程中，还使用了由链霉亲和素(Streptavidin，SA)和辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)交联所得的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(HRP
‑
SA)，化学发光试剂苯甲酰甲醛(Phenylglyoxal，PG)。
[0008]具体采用以下技术方案：
[0009]1)将Apt1、Apt2、S1、B、S2混匀，充分反应；
[0010]2)将步骤1)所得产物与AFP及ATP混匀，充分反应；
[0011]3)通过氨羧反应将氨基修饰的C1固定在羧基磁性微球的表面，得到磁性微球
‑
C1复合物；
[0012]4)将步骤2)所得产物与过量的磁性微球
‑
C1复合物混匀，反应后取固相；
[0013]5)将步骤4)所得固相与SA
‑
HRP混匀，充分反应，即得检测AFP的化学发光生物传感器；
[0014]6)将检测AFP的化学发光生物传感器与鲁米诺
‑
H2O2试剂混匀，而后检测化学发光CL值；
[0015]7)通过氨羧反应将氨基修饰的C2固定在羧基磁性微球的表面，得到磁性微球
‑
C2复合物；
[0016]8)将步骤4)反应的剩余溶液与过量的磁性微球
‑
C2复合物混匀，反应后取固相，即得检测ATP的化学发光生物传感器；
[0017]9)将检测ATP的化学发光生物传感器与PG试剂混匀，而后检测化学发光CL值。
[0018]作为优选，步骤1)包括以下步骤：分别取6μL、100μM的Aptl、Apt2、S1、B、S2于1.5mL的离心管中，而后加入20μL的BA缓冲液，混匀后于80～100℃水浴锅中孵育4～6min，最后将其放于4℃冰箱过夜备用。
[0019]作为优选，步骤2)包括以下步骤：取10μL、10
‑8μM AFP和10μL、10
‑8μMATP于步骤1)所得溶液，混匀后于35～39℃震荡反应40～60min。
[0020]作为优选，步骤3)包括以下步骤：取磁性微球，利用0.05～0.2M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲液中，于35～39℃震荡孵育15～25min，而后以磁性微球与氨基修饰的C1用量比为4∶(1～2)(μg∶pmol)的比例加入氨基修饰的C1，于35～39℃震荡反应40～60min。
[0021]作为优选，步骤3)还包括以下步骤：于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用PBST缓冲溶液洗涤。
[0022]作为优选，步骤3)还包括以下步骤：利用PBST缓冲溶液洗涤后，取固相加入8～12％的BSA溶液，于35～39℃条件下震荡40～60min，而后取固相利用PBST缓冲溶液洗涤，即得磁性微球
‑
C1复合物。
[0023]作为优选，步骤4)包括以下步本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于自组装DNA核酸链传感器的多种肿瘤标记物化学发光快速检测方法，其特征在于，涉及三磷酸腺苷适体(Aptl)、甲胎蛋白适体(Apt2)、信号DNA链1(S1)、桥梁DNA链(B)、信号DNA链2(S2)、与S1互补的DNA链(e1)、与S2互补的DNA链(C2)；其中，ATP可与Apt1特异性识别，AFP可与Apt2特异性识别，S1可与C1碱基互补配对，S2可与C2碱基互补配对，B主要用于辅助构造自组装DNA核酸链，C1、C2末端的氨基可与羧基修饰的磁性微球通过酰胺键结合；过程中，还使用了由链霉亲和素(SA)和辣根过氧化物酶(HRP)交联所得的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(SA
‑
HRP)，化学发光试剂苯甲酰甲醛(PG)；该方法包括以下步骤：1)将Apt1、Apt2、S1、B、S2混匀，充分反应；2)将步骤1)所得产物与AFP及ATP混匀，充分反应；3)通过氨羧反应将氨基修饰的C1固定在羧基磁性微球的表面，得到磁性微球
‑
C1复合物；4)将步骤2)所得产物与过量的磁性微球
‑
C1复合物混匀，反应后取固相；5)将步骤4)所得固相与SA
‑
HRP混匀，充分反应，即得检测AFP的化学发光生物传感器；6)将检测AFP的化学发光生物传感器与鲁米诺
‑
H2O2试剂混匀，而后检测化学发光CL值；7)通过氨羧反应将氨基修饰的C2固定在羧基磁性微球的表面，得到磁性微球
‑
C2复合物；8)将步骤4)反应的剩余溶液与过量的磁性微球
‑
C2复合物混匀，反应后取固相，即得检测ATP的化学发光生物传感器；9)将检测ATP的化学发光生物传感器与PG试剂混匀，而后检测化学发光CL值。2.根据权利要求1所述的一种基于自组装DNA核酸链传感器的多种肿瘤标记物化学发光快速检测方法，其特征在于，步骤1)包括以下步骤：分别取等量6μL、100μmol/L的Apt1、Apt2、S1、B、S2于1.5mL的离心管中，而后加入20μL的BA缓冲液，混匀后于80～100℃水浴锅中孵育4～6min。3.根据权利要求1所述的一种基于自组装DNA核酸链传感器的多种肿瘤标记物化学发光快速检测方法，其特征在于，步骤2)包括以下步骤：取10μL、10
‑8μmol/LAFP和10μL、10
‑8μmol/LATP于步骤1)所得溶液，混匀后于35～39℃震荡反应40～60min。4.根据权利要求1所述的一种基于自组装DNA核酸链传感器的多种肿瘤标记物化学发光快速检测方法，其特征在于，步骤3)包括以下步骤：取磁性微球，利用0.05～0.2M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲液中，于35～39℃震荡孵育15～25min，而...

【专利技术属性】
技术研发人员：严喜鸾，王魏，朱娅妃，程诗云，刘阿花，戈文楷，束庆磊，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：