用于快速检测烟草靶斑病菌的引物和探针及应用、试剂盒和烟草靶斑病菌快速检测方法技术

本申请提供用于快速检测烟草靶斑病菌的引物和探针及应用、试剂盒和烟草靶斑病菌快速检测方法，涉及烟草防治技术领域。该用于快速检测烟草靶斑病菌的引物和探针通过试验优化筛选出，对烟草靶斑病菌具有较高的特异性，其扩增产物为单一条带，无非特异性扩增和明显的引物二聚体。通过该用于快速检测烟草靶斑病菌的引物和探针进行RPA扩增烟草靶斑病菌目的基因，并使用侧流层析试纸条进行可视化检测目的基因，具有灵敏度高、特异性好，且操作时间短的优点。优点。优点。

【技术实现步骤摘要】
用于快速检测烟草靶斑病菌的引物和探针及应用、试剂盒和烟草靶斑病菌快速检测方法


[0001]本申请涉及烟草防治
，尤其涉及用于快速检测烟草靶斑病菌的引物和探针及应用、试剂盒和烟草靶斑病菌快速检测方法。

技术介绍

[0002]烟草靶斑病是由立枯丝核引起的一种真菌性病害，瓜亡革菌的无性态为立枯丝核菌。烟草靶斑病从苗期至烟叶成熟时均可发生，既侵染叶片，也危害茎部。侵染叶片初为圆形水渍状斑点，如温度较高、湿度大、叶片湿润时间较长，则病斑迅速扩展，形成直径2
‑
20厘米的不规则斑，有同心轮纹，形成褪绿晕圈枯斑，病斑坏死部分易碎形成穿孔，形似枪弹射击后留下在靶子上的空洞，故称靶斑病。
[0003]烟草靶斑病不易被发现，一旦流行便发展迅速，防治困难，给农户们造成了极大的损失，阻碍了烟草种植产业的发展。目前对该病害的检测方法主要包括，病原菌分离和鉴定，以及普通的PCR和荧光定量PCR鉴定。这些方法对专业要求比较高，且过程繁琐，耗时长，不能达到高效经济地检测要求。

技术实现思路

[0004]本申请的目的在于提供用于快速检测烟草靶斑病菌的引物和探针及应用、试剂盒和烟草靶斑病菌快速检测方法，旨在解决现有的烟草靶斑病菌使用普通PCR进行检测，过程繁琐、耗时长的问题。
[0005]为实现以上目的，本申请提供用于快速检测烟草靶斑病菌的引物和探针，所述引物包括上游引物和下游引物；
[0006]所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；
[0007]所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；
[0008]所述探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示；
[0009]所述下游引物的5
’
端和所述探针的5
’
端分别具有抗原标记。
[0010]优选地，所述下游引物的5
’
端具有生物素标记，所述探针的5
’
端具有荧光标记；
[0011]所述荧光标记包括AMC、FAM、FITC中的任一种。
[0012]优选地，所述探针包括如下特征中的至少一个：
[0013]a.所述探针的中间序列含有核苷酸类似物；
[0014]b.所述核苷酸类似物包括四氢呋喃残基；
[0015]c.所述探针的3
’
端具有聚合酶延伸阻断基团；
[0016]d.所述聚合酶延伸阻断基团包括C3
‑
间隔基、磷酸基、双脱氧核苷酸中的任一种。
[0017]本申请还提供上述的用于快速检测烟草靶斑病菌的引物和探针在烟草靶斑病菌检测中的应用。
[0018]本申请还提供用于快速检测烟草靶斑病菌的试剂盒，包括上述的用于快速检测烟
草靶斑病菌的引物和探针。
[0019]优选地，所述试剂盒还包括重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶。
[0020]优选地，所述试剂盒还包括侧流层析试纸条，所述侧流层析试纸条包括检测带和质控带，所述检测带固定有生物素抗体，所述质控带固定有荧光标记抗体。
[0021]本申请还提供一种烟草靶斑病菌的快速检测方法，包括：
[0022]使用上述的用于快速检测烟草靶斑病菌的引物和探针对所述烟草靶斑病菌的DNA进行RPA扩增得到扩增产物；
[0023]将所述扩增产物使用侧流层析试纸条进行可视化检测。
[0024]优选地，所述RPA扩增的反应条件包括：反应温度37
‑
39℃，恒温孵育10
‑
30min。
[0025]优选地，使用上述的用于快速检测烟草靶斑病菌的引物和探针对所述烟草靶斑病菌的DNA进行RPA扩增得到扩增产物，包括：
[0026]将所述用于快速检测烟草靶斑病菌的引物和探针与Rehydration Buffer和所述烟草靶斑病菌的DNA进行混合得到混合物；
[0027]向所述混合物中加入MgAc充分混匀后进行RPA扩增。
[0028]与现有技术相比，本申请的有益效果包括：
[0029]本申请提供的用于快速检测烟草靶斑病菌的引物和探针通过试验优化筛选出，对烟草靶斑病菌具有较高的特异性，其扩增产物为单一条带，无非特异性扩增和明显的引物二聚体。通过该用于快速检测烟草靶斑病菌的引物和探针进行RPA扩增烟草靶斑病菌目的基因，并使用侧流层析试纸条进行可视化检测目的基因，具有灵敏度高、特异性好，且操作时间短的优点。
附图说明
[0030]为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对本申请范围的限定。
[0031]图1为烟草靶斑病菌RPA检测结果示意图，其中，1为烟草靶斑病菌的DNA为模板，2为超纯无菌水为模板的阴性对照；
[0032]图2a为烟草靶斑病菌RPA检测的特异性结果示意图；
[0033]图2b为烟草靶斑病菌普通PCR检测的特异性结果示意图；
[0034]图3a为烟草靶斑病菌RPA检测的灵敏性结果示意图；
[0035]图3b为烟草靶斑病菌普通PCR检测的灵敏性结果示意图；
[0036]图4a为烟草靶斑病菌RPA检测方法对烟草靶斑病样品的检测结果图；
[0037]图4b为烟草靶斑病菌通PCR检测方法对烟草靶斑病样品的检测结果图。
具体实施方式
[0038]如本文所用之术语：
[0039]“由
……
制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步
骤、方法、制品或装置所固有的要素。
[0040]连接词“由
……
组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由
……
组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
[0041]当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
[0042]在这些实施例中，除非另有指明，所述的份和百分比均按质量计。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于快速检测烟草靶斑病菌的引物和探针，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；所述探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示；所述下游引物的5
’
端和所述探针的5
’
端分别具有抗原标记。2.根据权利要求1所述的用于快速检测烟草靶斑病菌的引物和探针，其特征在于，所述下游引物的5
’
端具有生物素标记，所述探针的5
’
端具有荧光标记；所述荧光标记包括AMC、FAM、FITC中的任一种。3.根据权利要求2所述的用于快速检测烟草靶斑病菌的引物和探针，其特征在于，所述探针包括如下特征中的至少一个：a.所述探针的中间序列含有核苷酸类似物；b.所述核苷酸类似物包括四氢呋喃残基；c.所述探针的3
’
端具有聚合酶延伸阻断基团；d.所述聚合酶延伸阻断基团包括C3
‑
间隔基、磷酸基、双脱氧核苷酸中的任一种。4.根据权利要求1至3任一项所述的用于快速检测烟草靶斑病菌的引物和探针在烟草靶斑病菌检测中的应用。5.用于快速检测烟草靶斑病菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至3任一项所述的用于快速检测烟...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖艳松，邓茹婧，周乾，李生，谭志鹏，李思军，李奇，胡久伟，钟杰，李丽娟，胡琦，李宏光，吴文信，刘永斌，于法辉，
申请(专利权)人：湖南省烟草公司郴州市公司，
类型：发明
国别省市：