棉花耐盐负调控基因GhFB15及应用制造技术

本发明专利技术公开了一个棉花耐盐负调控基因GhFB15及其应用，通过生物技术克隆了该基因的CDS序列，并通过亚细胞定位确定该基因在细胞核内表达；利用qRT

【技术实现步骤摘要】
棉花耐盐负调控基因GhFB15及应用


[0001]本专利技术涉及棉花耐盐基因研究
，更具体地说是涉及GhFB15基因在植株耐盐中的应用、表达载体及引物。

技术介绍

[0002]盐害是沿海滩涂地区作物常见的非生物胁迫。为了加速盐碱地开发利用，就迫切需要能够适应高盐分生长的植物，并产生较好的经济效益，而棉花正是能够满足这种需要的特种经济作物。棉花耐盐性较强，是盐碱地的先锋作物。因缺乏高抗的陆地棉资源，棉花耐盐常规育种进展缓慢，不能满足生产的需求。
[0003]棉属种间的耐盐性差异比较大，刘国强等对棉花4个栽培种4078份品种资源的0.3％NaCl耐盐性苗期鉴定表明，栽培品种的耐盐性异很大。其中非洲棉和海岛棉的耐盐性比陆地棉和亚洲棉突出很多。叶武威等利用0.4％盐量胁迫法对47份陆地棉资源进行了耐盐鉴定，结果显示相对耐盐成活苗率最高的可达76.15％，属抗盐级别，而最低的只有22.07％属于不耐级别。棉花品种间耐盐性差异可能与各自的起源、遗传背景有直接关系，因此，挖掘与棉花盐胁迫相关的功能基因对开展棉花抗逆分子育种具有重要意义。
[0004]因此，如何提供一种耐盐基因，并将该基因应用于棉花耐盐中是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术发现了一个棉花耐盐负调控基因GhFB15，通过对该基因结构分析、亚细胞定位、转基因及沉默该基因表达分析，得出了该负调控基因有潜力应用于基因编辑培育耐盐新品种，并且对棉花耐盐定向遗传改良有重要意义。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种生物材料，所述生物材料为降低GhFB15基因表达的核苷酸分子，所述核苷酸分子敲除GhFB15基因或降低GhFB15基因表达后，提高了棉花植株的耐盐性。
[0008]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护一种蛋白，所述蛋白包括如下1)
‑
4)所示任意一种：
[0009]1)GhFB15蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0010]2)与SEQ ID NO.1所示的序列具有相同功能，且通过取代缺失或增加一个或多个氨基酸而获得的序列；
[0011]3)与SEQ ID NO.1所示的蛋白质具有相同功能，且N端或C端连接标签得到的融合蛋白质。
[0012]作为与上述技术方案优选的技术方案，本专利技术还请求保护编码上述1)
‑
3)所述蛋白的编码基因。
[0013]作为上述技术方案优选的技术方案：所述编码基因为如下中至少一种：
[0014]1)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
[0015]2)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交且编码权利要求2所述蛋白质的DNA分子；
[0016]3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有90％以上的同一性且编码权利要求2所述蛋白质的核苷酸序列；
[0017]4)由SEQ ID NO.2所示的序列通过取代、缺失或增加核苷酸而获得的序列；
[0018]5)由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列产生不同的转录本或者同源基因序列。
[0019]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护敲除上述1)
‑
5)编码基因或降低所述基因表达在选育耐盐棉花品种中的应用。
[0020]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护上述1)
‑
5)编码基因在制备非耐盐棉花实验材料中的应用。
[0021]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护一种克隆、鉴定GhFB15基因的引物，其特征在于，所示引物如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示。
[0022]经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术筛选到一个棉花耐盐负调控基因，通过蛋白亚细胞定位分析、基因结构和蛋白结构分析，可知，该基因编码的蛋白主要在细胞核中，调控细胞核基因的表达，同时，该GhFB15蛋白由173个氨基酸组成，预测其分子量为19.77kDa，等电点为8.31。GhFB15基因CDS序列在232
‑
339位含有一个F
‑
box
‑
like super family结构域。利用TMHMM及TMpred对GhFB15蛋白质进行跨膜结构分析，结果均未发现跨膜结构，表明GhFB15可能不是一个跨膜蛋白。通过Signal IP5预测，该蛋白没有信号肽结构，说明GhFB15不是分泌蛋白。SOPMA分析结果表明GhFB15蛋白的二级结构无规则卷曲(Random coil)氨基酸残基有95个，占54.91％，组成该蛋白的主体结构；α螺旋(Alphahelix)包含47个氨基酸残基，占27.17％；延伸链(Extended strand)包含28个氨基酸残基，占16.18％。进一步利用ESyPred3D Web Server对GhFB15三维结构预测，结果显示GhFB15三级结构组成与二级结构预测结构基本一致。
[0023]进一步，本专利技术通过将GhFB15基因转化至拟南芥中，并给予盐胁迫，观察拟南芥根长和生长状态，进一步验证该基因的存在，降低了植株耐盐胁迫的功能；同时，本专利技术利用plantCARE(https://www.plantcare.co.uk/)网站，对GhFB15基因上游2000bp启动子序列中的顺式作用元件进行分析，其包含1个逆境胁迫诱导的TC
‑
rich repeats，WRKY结合的顺式作用元件Wbox、茉莉酸、赤霉素等激素诱导的顺式作用元件以及多个光诱导的顺式作用元件，结果发现系列胁迫响应相关元件HSE和TC－richrepeat。因此推测GhFB15基因的表达很可能受到逆境胁迫调控；在此基础上，本专利技术对4叶期棉花根部组织进行200mmol/L浓度NaCl、GA、ET、MeJA和ABA处理，进一步得出GhFB15基因在棉花应答非生物物胁迫中起重要作用，尤其响应盐胁迫更为敏感，与棉花盐胁迫密切相关。
[0024]综上所述，本专利技术发现了负调控盐胁迫基因GhFB15有潜力应用于基因编辑培育耐盐新品种，并且对棉花耐盐定向遗传改良有重要意义
附图说明
[0025]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据
提供的附图获得其他的附图。
[0026]图1附图为GhFB15蛋白的二级和三级结构预测图；
[0027]图2附图为GhFB15蛋白的亚细胞定位情况图；
[0028]图3附图为GhFB15基因荧光定量结果图；
[0029]图4附图为GhFB15基因在盐及激素诱导下的响应情况图；
[0030]图5附图为GhFB15基因转化至拟南芥中，对拟南本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物材料，所述生物材料为降低GhFB15基因表达的核苷酸分子，所述核苷酸分子敲除GhFB15基因或降低GhFB15基因表达后，提高了棉花植株的耐盐性。2.一种蛋白，其特征在于，所述蛋白包括如下1)
‑
4)所示任意一种：1)GhFB15蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；2)与SEQ ID NO.1所示的序列具有相同功能，且通过取代缺失或增加一个或多个氨基酸而获得的序列；3)与SEQ ID NO.1所示的蛋白质具有相同功能，且N端或C端连接标签得到的融合蛋白质。3.编码权利要求2所述蛋白的编码基因。4.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下中至少一种：1)SEQ ID ...

【专利技术属性】
技术研发人员：王永强，耿昭，赵贵元，刘建光，张寒霜，豆海宽，刘旭，李梦喆，安泽彤，
申请(专利权)人：河北省农林科学院棉花研究所河北省农林科学院特种经济作物研究所，
类型：发明
国别省市：