一种控制海马胆碱能神经再生的方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种控制海马胆碱能神经再生的方法和应用，其包括：切割穹窿海马伞后侧脑室灌注NGF，能提高海马齿状回中的ChAT活性；将Lhx8干扰慢病毒注入脑室灌注NGF的正常海马齿状回后，齿状回中Lhx8和ChAT基因和蛋白水平下调，且影响ChAT阳性的胆碱能神经元再生；将Lhx8干扰慢病毒注入脑室灌注NGF并切割穹窿海马伞侧的海马齿状回后，齿状回中Lhx8和ChAT基因和蛋白水平显著下调，且抑制了齿状回的胆碱能神经再生。本发明专利技术经过研究发现干扰Lhx8能显著影响海马区域内NSCs向胆碱能神经元分化，这一研究成果将为临床治疗阿尔茨海默病等神经退行性疾病提供新思路。退行性疾病提供新思路。退行性疾病提供新思路。

【技术实现步骤摘要】
一种控制海马胆碱能神经再生的方法和应用


[0001]本专利技术属于神经生物
，具体涉及一种控制海马胆碱能神经再生的方法和应用。

技术介绍

[0002]中枢神经系统(Central nervous system，CNS)损伤后的神经再生是长期困扰人类的一大难题。神经干细胞(Neural stem cells，NSCs)具备自我更新、多向分化潜能及迁移性等特征，使其成为人类神经系统损伤以及退行性疾病治疗的理想细胞。目前已知海马齿状回是干细胞的聚集区之一。
[0003]海马中的胆碱能投射纤维主要来源于基底前脑内侧隔核(Medial septal nucleus，MS)和斜角带垂直臂核(Nucleus of the vertical limb of the diagonal band，VDB)。MS、VDB与海马结构中的齿状回(Dentate gyrus，DG)之间的胆碱能投射系统进行性损伤可导致海马区域乙酰胆碱(Acetylcholine，ACh)递质水平异常，动物出现学习、记忆等认知功能障碍的表现。
[0004]基于以上背景，若能探明海马齿状回胆碱能神经再生情况及其机制，将为临床治疗阿尔茨海默病(Alzheimer Disease，AD)等神经退行性疾病提供新思路。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供一种控制海马胆碱能神经再生的方法和应用，发现了能够影响海马齿状回胆碱能神经再生的关键转录因子，即Lhx8(LIM homebox protein 8，LIM同源盒基因8)，并通过干扰Lhx8显著影响了海马区域内NSCs向胆碱能神经元分化，为神经退行性疾病治疗提供了新思路。
[0006]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0007]一种控制海马胆碱能神经再生的方法，包括以下步骤：
[0008]步骤1)切割大鼠的穹窿海马伞后，侧脑室灌注5μL 2μg/μL的NGF，能提高大鼠的海马齿状回中的ChAT活性，从而促进海马胆碱能神经再生；
[0009]步骤2)将10μL Lhx8干扰慢病毒注入脑室灌注NGF的正常大鼠的海马齿状回后，大鼠的海马齿状回中Lhx8和ChAT基因及蛋白水平下调，且影响ChAT阳性的海马胆碱能神经元再生；
[0010]步骤3)将10μL Lhx8干扰慢病毒注入脑室灌注NGF并切割穹窿海马伞侧的大鼠的海马齿状回后，大鼠的海马齿状回中Lhx8和ChAT基因及蛋白水平显著下调，且抑制了齿状回的海马胆碱能神经再生。
[0011]优选地，所述Lhx8干扰慢病毒的滴度为8
×
108TU/mL。
[0012]一种控制海马胆碱能神经再生的方法在制备神经退行性疾病的药物中的应用。
[0013]优选地，所述神经退行性疾病为阿尔茨海默病。
[0014]本专利技术的原理及有益效果如下：
[0015]在正常大鼠海马齿状回内几乎不存在ChAT阳性的胆碱能神经元，而只含有来自基底前脑胆碱能神经元的投射纤维，而神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)可为切割穹窿海马伞后基底前脑内侧隔核和斜角带垂直臂核中的胆碱能神经元免于死亡提供部分保护作用，从而改善切割穹窿海马伞动物的认知功能。本专利技术研究发现，切割穹窿海马伞后，海马齿状回门区和颗粒下层的自体及移植入的NSCs均能增殖、分化，LIM同源域转录因子之一的Lhx8基因表达水平呈现短暂性上调，此外，切割穹窿海马伞侧海马提取液模拟海马神经再生微环境可明显促进海马NSCs分化为AChE阳性神经元。这些结果说明切割大鼠穹窿海马伞后海马中某些物质表达增强，诱导NSCs迁移和向神经元或胆碱能神经元分化，后续的实验中还发现，Lhx8也能促进体外培养的海马新生神经元分化为胆碱能神经元，利用Lenti6.3
‑
Lhx8慢病毒过表达后可促进海马NSCs增殖并向ChAT阳性的胆碱能神经元，且这些细胞同时能表达Lhx8。证明在海马胆碱能神经再生中，Lhx8起了重要作用，干扰Lhx8能显著影响海马区域内NSCs向胆碱能神经元分化。本专利技术的这一研究成果，将为临床治疗阿尔茨海默病等神经退行性疾病提供新思路。
附图说明
[0016]图1为分别选择MOI＝0，10，20，50，100进行慢病毒感染预实验的结果(标尺＝50μm)：A
‑
E分别为MOI＝0，10，20，50，100转染条件下，荧光显微镜下所见EGFP绿色荧光；F
‑
J分别为相应转染条件下Hoechst染色结果；K
‑
O分别为相应的EGFP和Hoechst合成图；P为不同MOI时，EGFP阳性细胞占总细胞数的百分比；
[0017]图2为Real
‑
time PCR和Western Blot检测各组中Lhx8的基因(A)和蛋白(B)表达水平；
[0018]图3为各组的MAP2/ChAT免疫荧光双标检测结果(标尺＝50μm)：A
‑
L分别为各组的染色结果，M为各组ChAT阳性细胞占MAP2阳性神经元比例的统计学分析结果；
[0019]图4为各组的免疫荧光检测结果(A
‑
C中：实线方框外标尺＝50μm；实线方框内标尺＝20μm)：A为Lhx8/ChAT免疫荧光双标细胞的染色结果，B为BrdU和Lhx8免疫荧光双标细胞的染色结果，C为BrdU和ChAT免疫荧光双标细胞的染色结果，D为各组双标细胞统计学分析结果；
[0020]图5为Real
‑
time PCR检测各组中Lhx8(A)和ChAT(B)基因表达情况；
[0021]图6为Real
‑
time PCR检测各组中Lhx8(A)和ChAT(B)基因表达水平；
[0022]图7为Western Blot检测各组中Lhx8(A)和ChAT(B)蛋白表达情况；
[0023]图8为Western Blot检测各组中Lhx8(A)和ChAT(B)蛋白表达水平。
具体实施方式
[0024]下面结合附图与具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。
[0025]实施例1
[0026]一种控制海马胆碱能神经再生的方法，具体步骤如下：
[0027](1)切割大鼠的穹窿海马伞后，侧脑室灌注5μL NGF(浓度为2μg/μL)，能提高大鼠的海马齿状回中的ChAT活性，从而促进海马胆碱能神经再生。
[0028](2)将10μL Lhx8干扰慢病毒(滴度为8
×
108TU/mL)注入脑室灌注NGF的正常大鼠
的海马齿状回后，大鼠的海马齿状回中Lhx8和ChAT基因及蛋白水平下调，且影响ChAT阳性的海马胆碱能神经元再生。
[0029](3)将10μL Lhx8干扰慢病毒(滴度为8
×
108TU/mL)注入脑室灌注NGF并切割穹窿海马伞侧的大鼠的海马齿状回后，大鼠的海马齿状回中Lhx8和ChAT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种控制海马胆碱能神经再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)切割大鼠的穹窿海马伞后，侧脑室灌注5μL 2μg/μL的NGF，能提高大鼠的海马齿状回中的ChAT活性，从而促进海马胆碱能神经再生；步骤2)将10μL Lhx8干扰慢病毒注入脑室灌注NGF的正常大鼠的海马齿状回后，大鼠的海马齿状回中Lhx8和ChAT基因及蛋白水平下调，且影响ChAT阳性的海马胆碱能神经元再生；步骤3)将10μL Lhx8干扰慢病毒注入脑室灌注NGF并切割穹窿海马...

【专利技术属性】
技术研发人员：施金洪，李浩明，衣昕，何辉，金国华，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：