靶向STAT3蛋白Tyr705磷酸化的肽及其应用制造技术

本申请中公开了靶向STAT3蛋白Tyr705磷酸化的抗原肽及其应用。该抗原肽具有如SEQ ID NO.6～9所示的氨基酸序列、或具有该序列功能相同的氨基酸同源序列。应用该抗原肽制备的抗体可以识别ΔS701及FL亚型的Tyr705磷酸化水平，这将对探索STAT3蛋白ΔS701亚型在细胞内的机制研究以及在动物体和人体内的生物学功能研究及药物开发将具有重大意义。另外，本申请中公开了一种STAT3蛋白Tyr705磷酸化抗体的制备方法，通过所述方法制备的抗体特异性强、纯度高、稳定性好。稳定性好。稳定性好。

【技术实现步骤摘要】
靶向STAT3蛋白Tyr705磷酸化的肽及其应用


[0001]本申请属于STAT3蛋白磷酸化检测
，本申请公开了靶向STAT3蛋白Tyr705磷酸化的抗原肽及其应用，具体而言涉及能够将肽作为抗原制备靶向识别STAT3蛋白Tyr705磷酸化的抗体及其作为检测STAT3蛋白Tyr705磷酸化水平的应用。

技术介绍

[0002]信号传导及转录激活蛋白(signal transducer and activator of transcription,STAT)是一种具有DNA结合活性的蛋白质家族，包括STAT1～STAT6。其中，STAT3是该家族中唯一的胚胎致死的核转录因子，其影响超过1000个基因产物的表达。
[0003]STAT3蛋白结构包括N
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末端结构域、DNA结合域、卷曲螺旋结构域、SH2结构域、C
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末端转录激活结构域，其中SH2结构域最为保守。当细胞受到营养、炎症、生长信号等刺激时，STAT3蛋白的Tyr705位点受JAK激酶催化发生磷酸化，促使两个STAT3单体发生二聚化，由细胞质转位至细胞核，进而参与靶基因的转录调控。因此，通过检测细胞中STAT3蛋白的Tyr705位点磷酸化水平，可以间接探究细胞生长、增殖、代谢、炎症等生物学过程。
[0004]目前，现有技术主要通过STAT3蛋白Tyr705磷酸化抗体(例如Cell Signaling Technology/CST公开的Cat.9145的抗体)及其抗体试剂盒来检测STAT3蛋白Tyr705磷酸化水平。然而，NCBI数据库显示，STAT3根据基因内含子的不同剪接而产生四种不同的蛋白亚型：α亚型、β亚型，αΔS701亚型、βΔS701亚型，现有技术提供的抗体不能有效地检测STAT3蛋白αΔS701亚型、βΔS701亚型的Tyr705磷酸化水平。

技术实现思路

[0005]在此基础上，本申请专利技术人对STAT3蛋白的不同亚型进行了深入研究(如图1所示)，STAT3基因在其第21位内含子存在一隐含剪接位点，该位点的可变剪接产生的两种蛋白亚型仅有是否包含第701位丝氨酸(Ser701)的差异，从而进一步将STAT3蛋白分为不含Ser701的亚型(后文简称ΔS701亚型)、以及含有Ser701(简称FL亚型)两种亚型。而人类细胞中存在STAT3ΔS701亚型约占STAT3总数的17％～22％。然而，现有的商业化抗体(例如Cat.9145，Cell Signaling Technology，CST)无法识别STAT3蛋白ΔS701亚型的Tyr705磷酸化信号。为此，本申请实施例至少公开了如下技术方案：
[0006]第一方面，本申请实施例公开了一种抗原肽，所述抗原肽具有靶向STAT3蛋白FL亚型和ΔS701亚型的Tyr705磷酸化位点的免疫原性，其中，所述抗原肽具有如(I)～(III)中的至少一项所示的氨基酸序列：
[0007](I).SEQ ID NO.6～9所示的氨基酸序列；
[0008](II).与(I)所述序列至少具有75％相似性的氨基酸序列；
[0009](III).具有与(I)或(II)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸序列获得的氨基酸序列，且与(I)或(II)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；
[0010](IV).(I)、(II)或(III)所述抗原肽或在其氨基酸序列中的部分或全部氨基酸残基处被修饰。
[0011]第二方面，一种抗原构建体，所述抗原构建体包含第一方面抗原肽及用于负载或偶联所述第一方面的抗原肽的载体。
[0012]第三方面，本申请实施例还公开了第一方面所述的抗原肽及第二方面所述的抗原构建体的应用，所述应用包括如下至少一项：
[0013](1)制备STAT3蛋白的Tyr705磷酸化特异性抗体；
[0014](2)制备STAT3蛋白的Tyr705磷酸化相关疾病的疫苗；
[0015](3)用作炎症性疾病治疗药物；
[0016](4)共刺激分子拮抗剂；
[0017](5)免疫抑制剂。
[0018]第四方面，本申请实施例公开了一种抗体，所述抗体与第一方面所述的抗原肽、或与第二方面所述的构建体进行特异性结合。
[0019]第五方面，本申请实施例公开了第四方面所述抗体的制备方法，包括将第一方面所述的抗原肽、或与第二方面所述的构建体进行动物免疫，收集抗血清和纯化的步骤。
[0020]第六方面，本申请实施例公开了一种ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒包括第四方面所述的抗体，所述ELISA试剂盒用于检测STAT3蛋白ΔS701亚型和FL亚型的Tyr705位点的磷酸化水平。
[0021]第七方面，本申请实施例公开了一种药物组合物，其包括第四方面所述的抗体，以及药学上可接受的辅料或者载体。
[0022]与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果之一：
[0023]本申请实施例公开的抗原肽具有STAT3蛋白Tyr705磷酸化的免疫原性，其能够在体内产生免疫应答，进而产生一种能够同时特异性识别各种STAT3蛋白亚型pTyr705的磷酸化抗体，从而极大地提高对STAT3蛋白pTyr705的检测覆盖率。
附图说明
[0024]图1为本申请提供的各物种中STAT3蛋白αFL、αΔS701、βFL和βΔS701亚型的存在情况。
[0025]图2为本申请实施例提供的人类细胞中存在STAT3蛋白ΔS701亚型及含量分析结果图。
[0026]图3为本申请实施例提供的磷酸化抗原肽HPLC纯度测定结果。
[0027]图4为本申请实施例提供的非磷酸化抗原肽HPLC纯度测定结果。
[0028]图5为本申请实施例提供的不同STAT3蛋白突变体的表达质粒电泳图(a)、测序比对图(b)以及自制抗体与商用抗体检测不同STAT3蛋白亚型的WesternBlot检测图(c)；
[0029]图5a中，从左至右的泳道依次为Marker、pCDNA3.1
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GFP、pCDNA3.1
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GFP
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STAT3
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FL、pCDNA3.1
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GFP
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STAT3
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ΔS701和pCDNA3.1
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GFP
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STAT3
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Y705F；图5b中为pCDNA3.1
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GFP
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STAT3
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FL、pCDNA3.1
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GFP
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STAT3
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ΔS701和pCDNA3.1
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GFP
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STAT3
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Y705F的测序比对结果图；图5c中，泳道1、2、3所示均为pCDNA3.1
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GFP
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S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分离的抗原肽，所述抗原肽具有靶向STAT3蛋白的Tyr705磷酸化位点的免疫原性，其中，所述抗原肽选自如(I)～(IV)中的至少一项：(I).具有如SEQ ID NO.6～9任一所示的氨基酸序列；(II).与(I)所述序列至少具有75％相似性的氨基酸序列；(III).具有与(I)或(II)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸序列获得的氨基酸序列，且与(I)或(II)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；(IV).(I)、(II)或(III)所述肽在其氨基酸序列中的部分或全部氨基酸残基处被修饰。2.一种抗原构建体，所述抗原构建体包含权利要求1所述的抗原肽及用于负载或偶联权利要求1所述的抗原肽的载体。3.根据权利要求2所述的抗原构建体，其中，所述载体是脂质体。4.根据权利要求2所述的抗原构建体，其中，所述载体选自匙孔槭血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵白蛋白(OVA)、牛甲状腺球蛋白(THY)、灭活百日咳毒素、B群脑膜炎球菌外膜蛋白、绿脓杆菌外毒素A、霍乱毒素B亚单位、细菌外膜蛋白、大肠杆菌热敏感肠毒素、肺炎球菌溶血素、淋球菌菌毛蛋白和革兰氏阴性菌的脂多糖中的一种。5.权利要求1所述的抗原肽、或权利要求2～4任一所述的抗原构建体的应用，所述应用包括如下至少一项：(1)制备STAT3蛋白的Tyr705磷酸化特异性抗体；(2)制备STAT3蛋白的Tyr705磷酸化相关疾病的疫苗；(3)用作炎症性疾病治疗药物；(4)共刺激分子拮抗剂；(5)免疫抑制剂。6.一种抗体，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：仝晶晶，王志华，徐梦，钟书，朱双蝶，罗杰，
申请(专利权)人：华中师范大学，
类型：发明
国别省市：