一种梨致病型链格孢菌RPA检测的特异性引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种梨致病型链格孢菌RPA检测的特异性引物及其应用，涉及植物病害检测技术领域，所述特异性引物的核苷酸序列为：上游引物：5

【技术实现步骤摘要】
一种梨致病型链格孢菌RPA检测的特异性引物及其应用


[0001]本专利技术涉及植物病害检测
，具体涉及一种梨致病型链格孢菌RPA检测的特异性引物及其应用。

技术介绍

[0002]梨是我国三大水果产业之一，而梨致病型链格孢菌导致的梨黑斑病是梨树上重要的病害之一，在中国主要梨区普遍发生。该病害主要危害叶片、果实及新梢，可引起早期落叶、落果，嫩梢枯死，直接影响梨的产量和品质。我国是梨果品出口大国，梨的安全生产及出口贸易极为重要，由于传统的植物病原真菌的检测方法耗时长，程序繁琐，易受到人为因素和环境条件的干扰，不适合快速检测的要求。因此，研究快速简便的检测方法对梨黑斑病的田间早期检测和口岸检验检疫具有现实意义。
[0003]虽然链格孢菌广泛分布在植物、土壤和有机质中，但致病型的链格孢菌会对寄主植物产生选择性毒素。寄主选择性毒素是决定链格孢菌寄主范围和寄主高度专化性的致病因子，其中导致梨黑斑病的梨致病型链格孢菌会产生AK毒素。
[0004]重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)技术是一种新型恒温扩增技术，在25
‑
43℃恒温条件下反应5
‑
30min就可以扩增出检测产物，不需要昂贵的变温实验仪器，且反应快速、灵敏度高、特异性强。目前该技术已成功应用于病毒、细菌、真菌等多种病原物的检测中，但对于梨致病型链格孢菌的RPA检测尚未见报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种梨致病型链格孢菌RPA检测的特异性引物及其应用。
[0006]本专利技术通过以下技术方案来实现上述目的：
[0007]本专利技术提供了一种梨致病型链格孢菌RPA检测的特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列为：
[0008]上游引物：5
’‑
TGCTATCCCTGTCCTCTCATTGGCTGTTTC
‑3’
，
[0009]下游引物：5
’‑
CATGCTGTCGTTTAGAGATAGTGGAGTCCG
‑3’
。
[0010]本专利技术还提供了一种如权利要求1所述的特异性引物在梨致病型链格孢菌快速检测中的应用。
[0011]本专利技术还提供了一种梨致病型链格孢菌RPA检测试剂盒，所述试剂盒含有上述特异性引物。
[0012]进一步改进在于，所述试剂盒还含有植物基因组DNA提取试剂盒、RPA扩增反应试剂、阳性对照物。
[0013]本专利技术还提供了一种梨致病型链格孢菌RPA检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0014](1)提取待测样品基因组DNA；
[0015](2)利用提取的样品基因组DNA进行RPA反应，利用上述特异性引物；
[0016](3)RPA反应完成后对反应产物进行检测，检测到目标扩增对象的即为阳性样品。
[0017]进一步改进在于，RPA反应的反应体系包含：权利要求1中所述的特异性引物、样品基因组DNA、RPA扩增反应试剂。
[0018]进一步改进在于，所述RPA扩增反应试剂包括以下成分：Buffer A、上游引物、下游引物、ddH2O和醋酸镁。
[0019]进一步改进在于，RPA反应条件为：反应温度为42℃，反应时间为30分钟。
[0020]进一步改进在于，所述步骤(3)中RPA反应完成后对反应产物进行检测，检测方法为将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析或者核酸测序。
[0021]进一步改进在于，进行琼脂糖凝胶电泳分析时，检测到242bp的条带即表明待测样品是阳性样品。
[0022]本专利技术提具有如下有益效果：
[0023]本专利技术提供了一种梨致病型链格孢菌RPA检测的特异性引物及其应用，首次将RPA技术应用于梨致病型链格孢菌的检测，建立了RPA快速检测体系，该检测体系与梨炭疽病、梨轮纹病、梨黑星病等常见病害的病原菌及其他致病型的链格孢菌均无交叉反应，特异性强。
[0024]RPA技术最大的优点在于恒温反应，不需要PCR仪等热循环设备，操作简单。有报道表明不利用任何仪器设备，仅靠人体体温即能完成RPA反应(Crannell Z A et al.，2014)，这大大增强了该技术在基层的推广使用。本研究建立的梨致病型链格孢菌RPA检测方法在兼具强特异性和高灵敏度等特点的同时，不需要PCR仪等热循环设备，操作简单，尤其适合在基层或者实验条件不足的实验室进行梨致病型链格孢菌的快速检测，对梨黑斑病的田间早期检测和口岸检验检疫具有现实意义。
附图说明
[0025]图1是梨致病型链格孢菌RPA引物筛选结果。从左到右依次为：DNA maker；试剂盒阳性对照；引物对AF
‑
1/AR
‑
1；引物对AF
‑
2/AR
‑
2；引物对AF
‑
3/AR
‑
3。
[0026]图2是梨致病型链格孢菌RPA特异性检测结果。A为引物对AF
‑
1/AR
‑
1特异性检测结果，B为引物对AF
‑
3/AR
‑
3特异性检测结果，其中从左到右依次均为DNA maker，Alternaria alternata，Botryosphaeria dothidea，Fusarium commune，Venturia nashicola，Gymnosporangium haraeanum，Colletotrichum gloeosporioides，Fusarium solani，Colletotrichum fructicola，Colletotrichum nymphaeae，ddH2O。
[0027]图3是不同链格孢菌的RPA检测结果。从左到右依次为：DNA maker；Alternaria alternata(梨)，Alternaria solani，Alternaria citri，Alternaria mali，Alternaria tenuissima，Alternaria infectoria，Alternaria porri，Alternaria gaisen，Alternaria tomato，Alternaria nelumbii，Alternaria alternata(桃)，Alternaria alternata(蓝莓)，Alternaria alternata(枇杷)，Alternaria alternata(柑橘)，ddH2O。
[0028]图4是RPA灵敏度检测结果。从左到右DNA模板浓度依次为1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL，100fg/μL，阴性对照(清水)。
[0029]图5是梨病害样品检测结果。从左到右依次为梨黑斑病病果，梨轮纹病病果、梨炭
疽病病果、梨锈病病叶、梨黑星病病叶，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种梨致病型链格孢菌RPA检测的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的核苷酸序列为：上游引物：5
’‑
TGCTATCCCTGTCCTCTCATTGGCTGTTTC
‑3’
，下游引物：5
’‑
CATGCTGTCGTTTAGAGATAGTGGAGTCCG
‑3’
。2.一种如权利要求1所述的特异性引物在梨致病型链格孢菌快速检测中的应用。3.一种梨致病型链格孢菌RPA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的特异性引物。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有植物基因组DNA提取试剂盒、RPA扩增反应试剂、阳性对照物。5.一种梨致病型链格孢菌RPA检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取待测样品基因组DNA；(2)利用提取的样品基因组DNA进行RPA反应，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨雪，潘锐，谷春艳，徐会永，臧昊昱，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所，
类型：发明
国别省市：