甘油脱氢酶突变体、产二羟基丙酮的工程菌及其用途制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了甘油脱氢酶突变体、产二羟基丙酮的工程菌及其用途。所述的甘油脱氢酶突变体是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的甘油脱氢酶为亲本，将亲本第527位突变和/或649位突变。本发明专利技术的甘油脱氢酶突变体能提高甘油脱氢酶表达量，本发明专利技术还利用构建了过表达上述突变体的工程菌，其能够将甘油高效转化为二羟基丙酮。高效转化为二羟基丙酮。

【技术实现步骤摘要】
甘油脱氢酶突变体、产二羟基丙酮的工程菌及其用途


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及甘油脱氢酶突变体、产二羟基丙酮的工程菌及其用途。

技术介绍

[0002]二羟基丙酮，又称1,3
‑
二羟基丙酮(1,3
‑
dihydroxyacetone)简写为DHA，是一种简单的多羟基类三碳酮糖。二羟基丙酮分子中含有一个酮基和两个羟基，因此化学性质活泼，可参与多种化学反应，是一种重要的生物和化工原料，广泛应用在化妆品、医药、食品和化工等领域。
[0003]二羟基丙酮的生产方法目前主要包括化学合成法和生物转化法。化学合成法目前主要有两种技术路线，一种路线是以甘油作为原料，利用金属催化剂选择性氧化甘油，从而得到二羟基丙酮，该方法中甘油的转化率较低，同时还伴有甘油醛副产物的产生，不利于产品的分离纯化；另外一种化学路线是甲醛在以含氮类杂环化合物等物质的催化下进行的甲醛自缩合反应，形成二羟基丙酮和二羟基丙酮聚合物，该方法存在二羟基丙酮的选择性低、成本过高等弊端。与化学合成法相比，生物转化法生产二羟基丙酮具有专一性强、反应条件温和、底物利用率高、副产物少、生产工艺简单的特点，同时生物法制备的二羟丙酮可应用于食品领域等优点，因此该方法成为了目前国内外生产二羟丙酮的主要手段。
[0004]生物转化法生产二羟基丙酮的原理是利用微生物代谢产生的甘油脱氢酶或二羟基丙酮合成酶的作用将甘油或其它底物转化为二羟基丙酮。其中用于二羟丙酮生产的微生物主要是醋酸杆菌属和葡萄糖酸杆菌属的一些菌株，其中尤以氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)应用最多。通过培养基成分和培养条件优化、菌种筛选与基因工程改造以及生物转化方式的改进，利用氧化葡萄糖酸杆菌转化甘油生产二羟基丙酮的产量不断得到提高。但是利用氧化葡萄糖酸杆菌生产二羟基丙酮的过程中，高浓度的底物甘油会抑制菌体生长和二羟基丙酮的生成，而高浓度的二羟基丙酮则会严重影响菌体对甘油的摄入速度，导致生物转化工艺中甘油的转化率和二羟基丙酮产量很难同时满足目前的工业化生产需要。

技术实现思路

[0005]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供甘油脱氢酶突变体、产二羟基丙酮的工程菌及其用途，以期解决现有技术中存在的微生物转化甘油生产二羟基丙酮的产量低以及底物甘油转化率低的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术具体采用如下技术方案。
[0007]本专利技术的第一方面保护甘油脱氢酶突变体，所述的突变体是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的甘油脱氢酶为亲本，将亲本第527位突变和/或第649位突变。
[0008]在本专利技术一些实施方式中，所述的突变为单突变或多突变。
[0009]在本专利技术一些实施方式中，将亲本第527位的色氨酸突变为丙氨酸。
[0010]在本专利技术某些具体实施方式中，将亲本第649位的酪氨酸突变为丙氨酸。
[0011]在本专利技术某些具体实施方式中，将亲本第527位的色氨酸突变为丙氨酸，甘油脱氢酶突变体(简称为单突变体W527A)的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.3所示。
[0012]在本专利技术某些具体实施方式中，将亲本第527位的色氨酸突变为丙氨酸和亲本第649位的酪氨酸突变为丙氨酸，甘油脱氢酶突变体(简称为双突变体W527A
‑
Y649A)的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.5所示。
[0013]本专利技术的第二方面保护与上文所述的突变体相关的生物材料，包括如下技术特征中的至少一项：
[0014]a)编码如上文所述的突变体的核苷酸；
[0015]b)含有a)所述的核苷酸的重组表达载体；
[0016]c)含有a)所述的核苷酸的工程菌，或含有b)所述的重组表达载体的工程菌。
[0017]在本专利技术一些实施方式中，a)中，所述的核苷酸包括如SEQ ID NO.4所示序列或如SEQ ID NO.6所示。
[0018]本专利技术的第三方面保护产二羟基丙酮的工程菌，所述的工程菌过表达如上文所述的突变体。
[0019]在本专利技术一些实施方式中，所述的工程菌的出发菌株为能将甘油转化为二羟基丙酮的菌株。
[0020]在本专利技术某些具体实施方式中，所述的出发菌株选自醋酸杆菌属和葡萄糖酸杆菌属菌株。优选选自葡萄糖酸杆菌属菌株，更优选自葡萄糖酸杆菌，具体选自葡萄糖酸杆菌JBD。
[0021]在本专利技术一些实施方式中，所述的工程菌为氧化葡萄糖酸杆菌JBD7(Gluconobacter oxydans JBD7)，其保藏编号为CCTCC NO:M 2022993。
[0022]本专利技术的第四方面保护如上文所述的工程菌的构建方法，包括下列步骤：
[0023]1)将所述的甘油脱氢酶突变体、启动子、载体连接获得重组表达载体；
[0024]2)将所述的重组表达载体转化至出发菌株，得到所述的产二羟基丙酮的工程菌。
[0025]在本专利技术一些实施方式中，所述的载体选自pBBR1MCS
‑
2质粒、pBBR1MCS
‑
5质粒中的一种或两种。
[0026]在本专利技术一些实施方式中，所述的启动子选自tufB、gdh中的一种或两种。
[0027]在本专利技术一些实施方式中，所述的出发菌株为能将甘油转化为二羟基丙酮的菌株。
[0028]在本专利技术某些实施方式中，所述的出发菌株选自选自醋酸杆菌属和葡萄糖酸杆菌属菌株。更优选地，选自葡萄糖酸杆菌属菌株，进一步优选为葡萄糖酸杆菌，具体选自葡萄糖酸杆菌JBD。
[0029]本专利技术的第五方面保护如上文所述的突变体或如上文所述的生物材料或如上文所述的工程菌在生产二羟基丙酮中的用途。
[0030]本专利技术的第六方面保护一种二羟基丙酮的生产方法，包括如下步骤：采用如上文所述的工程菌，转化生二羟基丙酮。
[0031]在本专利技术一些实施方式中，所述的工程菌以甘油为碳源。
[0032]在本专利技术某些具体实施方式中，将所述的工程菌经种子培养和发酵培养，得到所
述的二羟基丙酮。
[0033]在本专利技术某些更具体实施方式中，所在本专利技术某些更具体实施方式中，所述的种子培养选用的种子培养基的组成为：甘油(1～2.5)g/100mL、酵母膏(1.0～2.6)g/100mL、磷酸二氢钾(0.2～0.4)g/100mL、碳酸钙(0.02～0.04)g/100mL，余量为水。
[0034]在本专利技术某些更具体实施方式中，将经种子培养获得的种子液以0.5～3％体积比接至发酵培养基，在发酵过程中分次补加甘油，使得甘油的终浓度为20～80g/L。
[0035]在本专利技术某些更具体实施方式中，所述的发酵培养基的组成为：甘油(10～20)g/100mL、酵母膏(0.5～2.5)g/100mL、磷酸二氢钾(0.2～0.4)g/100mL、碳酸钙(0.01～0.0.3)g/100mL，余量为水。所述的发酵培养基的pH值为7.5～8.0。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.甘油脱氢酶突变体，其特征在于，所述的突变体是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的甘油脱氢酶为亲本，将亲本第527位突变和/或649位突变。2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，将亲本第527位的色氨酸突变为丙氨酸；和/或，将亲本第649位的酪氨酸突变为丙氨酸。3.与权利要求1或2所述的突变体相关的生物材料，其特征在于，包括如下技术特征中的至少一项：a)编码如权利要求1或2所述的突变体的核苷酸；b)含有a)所述的核苷酸的重组表达载体；c)含有a)所述的核苷酸的工程菌，或含有b)所述的重组表达载体的工程菌。4.产二羟基丙酮的工程菌，其特征在于，所述的工程菌过表达如权利要求1或2所述的突变体。5.如权利要求4所述的工程菌，其特征在于，所述的工程菌的出发菌株为能将甘油转化为二羟基丙酮的菌株，优选选自醋酸杆菌属和葡萄糖酸杆菌属菌株；和/或，所述的工程菌为氧化葡萄糖酸杆菌BD7(Gluconobacter ox...

【专利技术属性】
技术研发人员：张保国，曾俊华，袁辰阳，张静娴，
申请(专利权)人：中国科学院上海高等研究院，
类型：发明
国别省市：