一种创制菠萝突变体的EMS离体诱变方法技术

本发明专利技术公开了一种创制菠萝突变体的EMS离体诱变方法，属于菠萝育种技术领域。本发明专利技术以菠萝叶基、黄白化苗茎段为外植体经诱导分化、增殖继代培养获得离体诱变材料，然后经EMS诱变处理、诱变处理后的恢复培养与分化诱导、M0群体幼苗的壮苗与生根、炼苗与移栽、表型观测与突变体筛选，创制了菠萝突变体。本发明专利技术提供的EMS离体诱变方法可以获取大量菠萝离体诱变材料，便于规模化开展菠萝人工诱变，提高诱变效率，诱导产生多种类型表型变异，获得表型变异丰富的M0突变群体，构建突变体库，有助于推动菠萝新种质创制与功能基因研究，为菠萝优异性状基因挖掘与应用、新品种选育提供材料支撑。撑。撑。

【技术实现步骤摘要】
一种创制菠萝突变体的EMS离体诱变方法


[0001]本专利技术涉及菠萝育种
，特别是涉及一种创制菠萝突变体的EMS离体诱变方法。

技术介绍

[0002]菠萝(Ananas comosus)是凤梨科(Bromeliaceae)凤梨属的一种具有重要经济价值的热带水果，因其香气诱人、风味独特而深受消费者喜爱。我国菠萝种植面积在2019年已突破6万公顷，产量达170多万吨。菠萝产业已成为我国广东、海南、广西、云南等热区农业的支柱产业之一。
[0003]我国菠萝产业存在较突出的品种同质化问题，以主产区广东徐闻为例，目前主栽品种仍为传统品种
‘
巴厘
’
，除了
‘
金钻
’
、
‘
金菠萝
’
等少数品种外，能够在一定范围内替代
‘
巴厘
’
的优良品种寥寥无几。究其原因，菠萝传统育种工作耗时耗力，获得可利用的有效遗传变异、培育新品种的周期长，因此利用诱变技术人工诱发遗传变异是创制新种质、选育新品种的重要手段。
[0004]甲基磺酸乙酯(EMS)是目前在作物诱变育种中应用最广泛、应用效果最好的一种化学诱变剂，EMS的诱变效应具有效率高、范围广的特点，较之其它的化学诱变剂，EMS诱变产生点突变的频率较高，染色体畸变相对较少，且多为显性突变体，易于进行突变体的筛选。目前普遍采用EMS处理种子的方法创制突变体，成功先例如水稻(CN105695477A)、小麦(CN109729972A)、油菜(CN110578015A)等，但对于菠萝而言，因其具有自交不亲和特性，一般没有种子，故需选择芽、愈伤组织等其它器官或组织进行EMS诱变处理。目前有关菠萝EMS诱变的相关研究报道十分鲜见，仅有黄俊生等(黄俊生,孔德赛,黄峰.EMS诱变菠萝愈伤组织选择抗性突变体的研究[J],热带作物学报,1995,16(12,增刊):1
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6)报道用0.25
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0.75％EMS浓度和10h诱变处理时间可以对菠萝愈伤组织进行有效诱变，但其研究止步于细胞水平的抗性筛选，并没有获得突变再生植株，至今也没有其他人开展进一步研究的报道，说明目前的菠萝EMS诱变相关研究存在一定局限性，用于创制突变体的菠萝EMS离体诱变方法体系还需进一步探索并完善。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种创制菠萝突变体的EMS离体诱变方法，以解决上述现有技术存在的问题，该方法便于多批次大批量进行菠萝EMS诱变，以提高创制获得突变种质的几率，为选育具有经济价值的菠萝新品种以及开展菠萝功能基因研究提供所需的大量突变体。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0007]本专利技术提供一种创制菠萝突变体的EMS离体诱变方法，包括：
[0008]以菠萝叶基、黄化苗茎段为外植体，诱导培养获取愈伤组织，将所述愈伤组织再经增殖继代培养获取离体诱变材料；所述离体诱变材料浸入浓度为0.5～0.8％的EMS溶液中
进行诱变处理5～8h，经恢复培养后获取存活的愈伤组织，之后经诱导分化、壮苗与生根、炼苗与移栽以及表型突变筛选，获得菠萝突变体。
[0009]优选的是，愈伤诱导培养基包括以下浓度组分：MS+2.0～3.0mg/L 6
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BA+2.0～2.5mg/L NAA+0.5mg/L 2,4
‑
D+30.0g/L蔗糖+7.0～8.0g/L卡拉胶，愈伤诱导条件为：25～27℃暗培养30～40d。
[0010]优选的是，增殖继代培养基包括以下浓度组分：MS+3.0～5.0mg/L 6
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BA+1.0～2.0mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+7.0～8.0g/L卡拉胶，增殖继代培养条件为：25～27℃暗培养20～40d。
[0011]优选的是，0.5～0.8％的EMS溶液以0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)为溶剂，EMS溶液配制、诱变处理均在室温、无菌条件下进行，诱变处理期间保持搅拌或振荡状态，诱变结束后用5％硫代硫酸钠溶液处理10～15min以终止反应。
[0012]优选的是，恢复培养采用增殖继代培养基，经25～27℃暗培养20d后，对存活的愈伤进行诱导分化；诱导分化培养基包括以下浓度组分：MS+2.0～3.0mg/L 6
‑
BA+1.0mg/L NAA+0～1.0mg/L ZT+30.0g/L蔗糖+7.0～8.0g/L卡拉胶，诱导分化条件为：光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为1200～2000lx，培养温度为25～27℃，培养时间为30～40d。
[0013]优选的是，将分化获得的M0群体幼苗转接到增殖继代培养基上进行壮苗培养，待幼苗长至5cm高后转接到生根培养基中诱导生根；其中，生根培养基包括以下浓度组分：1/2MS+2.5～5.0mg/L IBA+0～2.5mg/L NAA+15.0g/L蔗糖+7.0～8.0g/L卡拉胶，壮苗与生根培养条件为：光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为1200～2000lx，培养温度为25～27℃，培养时间为20～30d。
[0014]优选的是，移栽育苗基质为：泥炭与蚯蚓粪按照体积比7～9∶1～3混合，加入多菌灵或百菌清粉剂混合均匀制备而成。
[0015]优选的是，表型突变包括但不限于叶片失绿、叶片出现条纹或彩带、叶刺变异以及叶形或株型变异等。
[0016]本专利技术公开了以下技术效果：
[0017](1)利用本专利技术提供的菠萝EMS离体诱变方法，克服了菠萝芽等其它诱变材料受产生条件、数量、种植场地等因素影响的局限性，全年可开展多批次大批量的菠萝EMS离体诱变，大大提高了创制获得菠萝突变体的几率。
[0018](2)利用本专利技术提供的菠萝EMS离体诱变方法，可以在较短时间内获得多个具有明显表型变异且遗传背景一致的突变个体，并能够通过离体增殖、扩繁的方式较稳定地遗传、保存变异性状，可用于显性遗传突变的创制、重要性状的遗传解析、功能基因的挖掘以及新品系的选育等领域。
[0019](3)利用本专利技术提供的菠萝EMS离体诱变方法，可以获得完整的EMS诱变再生植株，便于移栽后进行田间表型性状跟踪观测，进一步明确其突变性状。
[0020](4)利用本专利技术提供的菠萝EMS离体诱变方法，可以获得大量突变体，突变性状包括但不限于叶片失绿、叶片出现条纹(或彩带)、叶刺变异、叶形或株型变异等，有利于创建菠萝突变体库，并开展较大规模的菠萝种质创新，且成本较低，应用性较好。
附图说明
[0021]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0022]图1为EMS处理后菠萝愈伤组织的相对转绿率和相对分化率；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种创制菠萝突变体的EMS离体诱变方法，其特征在于，包括：以菠萝叶基、黄化苗茎段为外植体，诱导培养获取愈伤组织，将所述愈伤组织经增殖继代培养获取离体诱变材料；所述离体诱变材料浸入浓度为0.5～0.8％的EMS溶液中进行诱变处理5～8h，经恢复培养后获取存活的愈伤组织，之后经诱导分化、壮苗与生根、炼苗与移栽以及表型突变筛选，获得菠萝突变体。2.如权利要求1所述的创制菠萝突变体的EMS离体诱变方法，其特征在于，愈伤诱导培养基包括以下浓度组分：MS+2.0～3.0mg/L 6
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BA+2.0～2.5mg/L NAA+0.5mg/L2,4
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D+30.0g/L蔗糖+7.0～8.0g/L卡拉胶，愈伤诱导条件为：25～27℃暗培养30～40d。3.如权利要求1所述的创制菠萝突变体的EMS离体诱变方法，其特征在于，增殖继代培养基包括以下浓度组分：MS+3.0～5.0mg/L 6
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BA+1.0～2.0mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+7.0～8.0g/L卡拉胶，愈伤增殖继代培养条件为：25～27℃暗培养20～40d。4.如权利要求1所述的创制菠萝突变体的EMS离体诱变方法，其特征在于，诱变处理期间保持搅拌或振荡状态，诱变结束后用5％硫代硫酸钠溶液处理10～15min以终止反应。5.如权利要求1所述的创制菠萝突变体的EMS离体诱...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴小红，陈晶晶，李栋梁，井敏敏，陈志辉，马朝明，顾帅磊，王禄利，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院南亚热带作物研究所，
类型：发明
国别省市：