分离纯化GluN2B蛋白用纤维膜、制备方法及应用技术

本发明专利技术属于生物医学工程领域，公开了一种分离纯化GluN2B蛋白用纤维膜、制备方法及应用。纤维膜由磷酸化的CaMKII蛋白通过磷酯键与PVA固体载体键合得到。制备方法包括：将PVA和CaMKII蛋白用三氯氧磷交联，制备PVA

【技术实现步骤摘要】
分离纯化GluN2B蛋白用纤维膜、制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物医学工程领域，具体涉及一种分离纯化GluN2B蛋白用纤维膜、制备方法及应用。

技术介绍

[0002]NMDAR受体，是一种离子型谷氨酸受体，其与突触的可塑性和学习记忆密切相关。通过该受体本身、其共轭的离子通道及调节部位3者形成的复合体而发挥功能，对Ca
2+
高度通透。每个NMDAR受体上含有两个谷氨酸和两个甘氨酸结合识别位点，谷氨酸和甘氨酸均是受体的特异性激活剂。它是中枢神经系统内一类重要的兴奋性氨基酸受体。NMDAR受体不仅在神经系统发育过程中发挥着重要的生理作用，如可调节神经元的存活，调节神经元树突、轴突结构发育及参与突触可塑性的形成等；在神经元回路的形成中NMDAR受体亦起着关键作用，有资料表明NMDAR受体是学习与记忆过程中一类至关重要的受体。
[0003]突触部位存在GluN2B的NMDA受体能保持活性连续的细胞交流，大量动物实验证据暗示存在GluN2B的NMDA受体诱导兴奋性毒性细胞死亡和β淀粉样蛋白(Aβ)突触功能障碍。因此，抑制GluN2B
‑
NMDA受体被认为是阿兹海默症提供神经保护和改善认知功能的一个潜在治疗策略。GluN2B蛋白被神经科学广泛关注。但是在神经科学研究过程中，分离纯化GluN2B蛋白难度较大。目前还没有简易可操作的标准化试剂盒及方法用于获得GluN2B蛋白。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种分离纯化GluN2B蛋白用纤维膜、制备方法及应用，该纤维膜制备方法简单，能够高效富集并纯化GluN2B蛋白。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：
[0006]一种分离纯化GluN2B蛋白用纤维膜，所述分离纯化GluN2B蛋白用纤维膜为PVA
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P
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CaMKII纳米纤维膜，所述PVA
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P
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CaMKII纳米纤维膜由磷酸化的CaMKII蛋白通过磷酯键与PVA固体载体键合得到。
[0007]本专利技术还提供了一种上述分离纯化GluN2B蛋白用纤维膜的制备方法，包括如下步骤：
[0008]S1.将PVA(聚乙烯醇)和CaMKII蛋白(钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II)混合冻干后研磨至5nm粉末，在氮气氛围下逐滴加入POCl3、吡啶与氯仿的混合制剂，0
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4℃反应20
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30min，之后升温至10
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15℃，继续反应20
‑
30min，最后升温至18
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20℃，继续反应20
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30min，加入丙酮洗涤3遍之后用氮气流吹干，得到PVA
‑
P
‑
CaMKII复合物；
[0009]S2.将所述PVA
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P
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CaMKII复合物溶于水，制得纺丝液，进行静电纺丝，得到纤维膜，将所述纤维膜用盐酸与戊二醛熏蒸交联得到PVA
‑
P
‑
CaMKII纳米纤维膜。
[0010]进一步的，上述制备方法的步骤S1中，PVA、CaMKII蛋白、POCl3、吡啶与氯仿的用量比例为(1
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3)g:(20
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45)mg:(10
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15)mL:(250
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320)μL:(10
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15)mL。
[0011]进一步的，上述制备方法的步骤S2中，所述纺丝液中，PVA
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P
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CaMKII复合物的质量百分比浓度为8
‑
10％。
[0012]进一步的，上述制备方法的步骤S2中，所述静电纺丝条件为：电压15
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20KV，距离10
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15cm，进样速率0.3
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0.7mL/h，温度25
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35℃，收集板为硅油纸。
[0013]进一步的，上述制备方法的步骤S2中，所述熏蒸交联操作中，盐酸的用量为每dm2的纤维膜10
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15mL，戊二醛用量为每dm2的纤维膜5
‑
8mL。
[0014]本专利技术还提供了上述的分离纯化GluN2B蛋白用纤维膜在分离纯化GluN2B蛋白中的应用。
[0015]进一步的，上述应用中，所述分离纯化GluN2B蛋白具体为：将PVA
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P
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CaMKII纳米纤维膜浸渍于含Ca
2+
的神经组织膜蛋白提取液中4℃振荡吸附20min，用PBS洗涤2次；再用含有EGTA的PBS缓冲液洗脱，经超滤离心管离心，PBS洗涤除去EGTA后，收集得到GluN2B蛋白。
[0016]进一步的，上述应用中，所述含Ca
2+
的神经组织膜蛋白提取液为含CaCl2的神经组织膜蛋白提取液，其中，CaCl2的浓度为2.0
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2.5mmol/L。
[0017]进一步的，上述应用中，所述含有EGTA的PBS缓冲液中，EGTA的浓度为2.5
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3.0mmol/L。
[0018]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0019]本申请通过采用PVA作为载体，将生物大分子CaMKII蛋白通过磷酯键键合到高生物亲和性大分子PVA上，制备PVA
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P
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CaMKII纳米纤维膜，实现了将生物大分子CaMKII蛋白固定到PVA载体上的同时实现了CaMKII蛋白的磷酸化，即激活了生物大分子CaMKII蛋白，在Ca
2+
存在时可以特异性结合GluN2B蛋白。利用本专利技术制备得到的纳米纤维膜进行常规的层析方法，通过EGTA螯合关键离子，解离洗脱目标蛋白，获得蛋白凝析缩合物，分离纯化微量蛋白。操作简易，速度快捷。
具体实施方式
[0020]根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。
[0021]实施例1
[0022]1、将2g PVA和32mg CaMKII蛋白混合冻干后研磨至5nm粉末，在氮气氛围下逐滴加入12mL POCl3、285μL吡啶与12mL氯仿的混合制剂，2℃反应28min，之后升温至12℃，继续反应25min，最后升温至19℃，继续反应25min，加入丙酮洗涤3遍之后用氮气流吹干，得到PVA
‑
P
‑
CaMKII复合物；
[0023]2、取0.9g步骤1制得的PVA
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P
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CaMKII复合物溶于9.1mL水，制得纺丝液，进行静电纺丝，电压17KV，距离12cm，进样速率0.5mL/h，温度30本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分离纯化GluN2B蛋白用纤维膜，其特征在于，所述分离纯化GluN2B蛋白用纤维膜为PVA
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P
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CaMKII纳米纤维膜，所述PVA
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P
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CaMKII纳米纤维膜由磷酸化的CaMKII蛋白通过磷酯键与PVA固体载体键合得到。2.一种权利要求1所述的分离纯化GluN2B蛋白用纤维膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.将PVA和CaMKII蛋白混合冻干后研磨至5nm粉末，在氮气氛围下逐滴加入POCl3、吡啶与氯仿的混合制剂，0
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4℃反应20
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30min，之后升温至10
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15℃，继续反应20
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30min，最后升温至18
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20℃，继续反应20
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30min，加入丙酮洗涤3遍之后用氮气流吹干，得到PVA
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P
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CaMKII复合物；S2.将所述PVA
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P
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CaMKII复合物溶于水，制得纺丝液，进行静电纺丝，得到纤维膜，将所述纤维膜用盐酸与戊二醛熏蒸交联得到PVA
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P
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CaMKII纳米纤维膜。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，PVA、CaMKII蛋白、POCl3、吡啶与氯仿的用量比例为(1
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3)g:(20
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45)mg:(10
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15)mL:(250
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320)μL:(10
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15)...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤佳鹏，鞠雨晴，姜辉，朱俐，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：