一种基于上转换内滤效应荧光-比色双模式检测血清中葡萄糖的方法技术

本发明专利技术涉及一种于上转换内滤效应荧光

【技术实现步骤摘要】
一种基于上转换内滤效应荧光
‑
比色双模式检测血清中葡萄糖的方法


[0001]本专利技术属于生物传感
，具体涉及一种基于上转换内滤效应荧光
‑
比色双模式检测荧光传感器的构建，进而实现对血清中葡萄糖的快速检测新方法。

技术介绍

[0002]葡萄糖是人类生命活动中的重要物质，它在人体血液中的含量对保障人体的正常工作有着很大的作用。血液中葡萄糖水平可以作为糖尿病或低血糖的诊断参考。因此，发展快速、准确的葡萄糖检测方法在临床诊断中具有重要的意义。
[0003]荧光光谱法因其灵敏、快速且操作简单而备受关注。目前，在荧光光谱法中，主要采有机染料和量子点等传统荧光探针材料。其中，有机染料因易受到光漂白的影响稳定性相对较差；量子点大多由高毒性无机材料制备。此外，他们均要求短波长激发，这可能会导致复杂样品中自发的背景荧光干扰。而上转换纳米材料(UCNPs)作为一种可以将近红外光转换成紫外光或可见光的纳米材料，具有低毒、大的反斯托克斯位移、耐光漂白、耐光学化学降解等优良的光学和化学特征，更重要的是该材料有窄的发射带宽、背景荧光几乎为零、大大改善了信噪比，因此被广泛用在在生物成像、生物传感器、光动力疗法等领域。
[0004]目前，UCNPs检测葡萄糖主要是基于供体UCNPs与受体之间的荧光共振能量转移(FRET)进行荧光猝灭，而且其猝灭效果依赖于两者之间的距离(通常小于10nm)。与FRET相比，荧光内滤效应(IFE)不依赖于荧光体和吸收体之间的距离，因此更加简单灵活，在分析检测中被广泛应用。但是，IFE仅在猝灭剂的吸收带与荧光团的激发和/或发射带相互重叠时才有效发生，这使得猝灭剂和荧光团的选择非常有限，从而很大程度地限制了基于IFE荧光测定方法的设计。因此，寻找合适的吸收剂
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荧光团对于构建基于IFE上转换荧光传感检测葡萄糖仍然是一个挑战。同时，比色法检测葡萄糖常用的显色底物是3,3',5,5'
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四甲基联苯胺(TMB)，然而其难溶于水，需要溶解在有机溶剂中。且TMB的氧化产物oxTMB作为IFE的吸收剂，其稳定性较差，实验中发现柠檬酸盐修饰的UCNPs便能使oxTMB褪色。这对在实际人血清中检测葡萄糖的准确性带来严重干扰。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种基于上转换内滤效应荧光
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比色双模式检测血清中葡萄糖的新方法。
[0006]本专利技术的目的通过如下技术方案实现：一种基于上转换内滤效应荧光
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比色双模式检测血清中葡萄糖的方法，所述的检测方法包括以下步骤：
[0007](1)采用高温热分解法制备六方相上转换纳米颗粒，再利用柠檬酸钠进行表面配体交换制得水溶性上转换纳米颗粒；
[0008](2)将葡萄糖、水溶性上转换纳米颗粒、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶和对苯二胺混合，孵育，测定混合液的紫外吸收强度和荧光强度，并计算荧光猝灭效率(F0‑
F)/F0，其
中，F0为葡萄糖浓度为零时，水溶性上转换纳米颗粒的荧光强度，F为水溶性上转换纳米颗粒与葡萄糖同存在时对应的荧光强度；
[0009](3)以葡萄糖浓度为横坐标，分别以紫外吸收强度和荧光猝灭效率(F0‑
F)/F0为纵坐标绘制标准曲线；
[0010](4)将待测血清样品加入步骤(2)所述的混合溶液中，并按照步骤(2)所述方法检测待测样品的紫外吸收强度和荧光强度；将所得紫外吸收强度和荧光强度数值带入步骤(3)获得的标准曲线中，再通过计算即得到血清样品中葡萄糖的浓度。
[0011]本专利技术的方法具体包括以下步骤：
[0012](1)OA
‑
UCNPs的制备
[0013]将236.6mg YCl3·
6H2O、77.5mg YbCl3·
6H2O、7.6mg ErCl3·
6H2O、6.0mL油酸(OA)和15.0mL 1
‑
十八碳烯混合，在氩气保护下加热至160℃，保持反应30min后冷却至40℃。将包含148.2mg NH4F、100mg NaOH的10mL甲醇混合液加入到上述反应液中成核30min，升温至80℃持续搅拌30min以完全蒸发甲醇，然后继续以15℃/min的速度将温度升至300℃反应60
‑
90min，冷却至室温，用体积比为1:1的环己烷
‑
乙醇在8000rpm转速下离心洗涤3次后，弃去上清液，将得到的固体产物放置在温度为70℃真空干燥，即得OA
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UCNPs；取10mg制得的OA
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UCNPs，放入3mL环己烷和2mL甲苯的混合溶液中充分溶解后备用。
[0014](2)Cit
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UCNPs的制备
[0015]将516.14mg柠檬酸钠和15mL的一缩二乙二醇，在氩气保护下，110℃反应30min后缓慢冷却到60℃，与步骤(1)所得的混合液混合，升温到130℃蒸发出环己烷以及甲苯。待蒸发结束以后，继续升高温度到180℃，观察溶液颜色变化，直到变为黄色。将混合液自然冷却到室温，在转速为12000rpm的条件下离心15min，用乙醇洗涤沉淀物三次，获得水溶性的柠檬酸钠修饰上转换纳米粒子(Cit
‑
UCNPs)。
[0016](3)标准曲线的绘制
[0017]将葡萄糖、Cit
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UCNPs、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶和对苯二胺混合，孵育，测定混合液的紫外吸收强度和荧光强度，并计算荧光猝灭效率(F0‑
F)/F0，其中，F0为葡萄糖浓度为零时，亲水性上转换纳米颗粒(即水溶性上转换纳米颗粒)的荧光强度，F为亲水性上转换纳米颗粒与葡萄糖同存在时对应的荧光强度；以葡萄糖浓度为横坐标，分别以紫外吸收强度和荧光猝灭效率(F0‑
F)/F0为纵坐标绘制标准曲线。
[0018](4)血清中葡萄糖浓度的检测
[0019]将待测血清样品加入步骤(3)所述的混合溶液中，并按照步骤(3)所述方法检测待测样品的紫外吸收强度和荧光强度；将所得紫外吸收强度和荧光强度数值带入步骤(3)获得的标准曲线中，再通过计算即得到血清样品中葡萄糖的浓度。
[0020]本专利技术的反应机制是基于内滤效应，其底物为对苯二胺，且浓度为2～16mmol/L；孵育温度为25～60℃；孵育时间为1～10min；pH为4.0～8.0；葡萄糖氧化酶浓度为25～200μg/mL；辣根过氧化物酶浓度为100～500ng/mL。
[0021]步骤(3)得到的荧光法标准曲线回归方程为Y＝0.122+0.0029X(5
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80μmol/L)，R2＝0.9967；Y＝0.235+0.0016X(80
‑
300μmol/L)，R2＝0.9956，其中，Y为(F0‑
F)/F0，X为葡萄糖浓度；
[0022]得到的比色法标本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于上转换内滤效应荧光
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比色双模式检测血清中葡萄糖的方法，其特征在于：所述的检测方法包括以下步骤：(1)采用高温热分解法制备六方相上转换纳米颗粒，再利用柠檬酸钠进行表面配体交换制得水溶性上转换纳米颗粒；(2)将葡萄糖、水溶性上转换纳米颗粒、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶和对苯二胺混合，孵育，测定混合液的紫外吸收强度和荧光强度，并计算荧光猝灭效率(F0‑
F)/F0，其中，F0为葡萄糖浓度为零时，水溶性上转换纳米颗粒的荧光强度，F为水溶性上转换纳米颗粒与葡萄糖同存在时对应的荧光强度；(3)以葡萄糖浓度为横坐标，分别以紫外吸收强度和荧光猝灭效率(F0‑
F)/F0为纵坐标绘制对应的标准曲线；(4)将待测血清样品加入步骤(2)所述的混合溶液中，并按照步骤(2)所述方法检测待测样品的紫外吸收强度和荧光强度；将所得紫外吸收强度和荧光强度数值带入步骤(3)获得的标准曲线中，再通过计算即得到血清样品中葡萄糖的浓度。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述水溶性上转换纳米颗粒为柠檬酸钠修饰的上转换纳米粒子(Cit
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UCNPs)，其制备方法包括以下步骤：步骤Ⅰ将236.6mg YCl3·
6H2O、77.5mg YbCl3·
6H2O、7.6mg ErCl3·
6H2O、6.0mL油酸(OA)和15.0mL 1
‑
十八碳烯混合，在氩气保护下加热至160℃，保持反应30min后冷却至40℃；将包含148.2mg NH4F、100mg NaOH的10mL甲醇混合液加入到上述反应液中成核30min，升温至80℃持续搅拌30min以完全蒸发甲醇，然后继续以15℃/min的速度将温度升至300℃反应60
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90min，冷却至室温，用体积比为1:1的环己烷...

【专利技术属性】
技术研发人员：林雅艳，吴用，关宏扬，付繁瑞，林雅彬，
申请(专利权)人：江西中科晏阳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：