同卵双胞胎家系人源B淋巴细胞系代谢物标准物质及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种同卵双胞胎家系人源B淋巴细胞系代谢物标准物质及制备方法和应用，包括从同卵双胞胎家系中父、母、子代双胞胎共4个人源B淋巴细胞系中提取的代谢物，其量值为父亲、母亲、一个子代分别与另一个子代中代谢物表达的比值。本发明专利技术的同卵双胞胎家系人源B淋巴细胞系代谢物标准物质可用于对代谢组检测进行质量控制和性能评价，也可用于评估和消除多批次检测中的技术噪音，为多中心、长期大队列研究的数据整合提供质量保证。列研究的数据整合提供质量保证。列研究的数据整合提供质量保证。

【技术实现步骤摘要】
同卵双胞胎家系人源B淋巴细胞系代谢物标准物质及制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及代谢组分析和代谢物标准物质领域，特别是涉及一种同卵双胞胎家系人源B淋巴细胞系代谢物标准物质和标准参考数据集的制备方法。

技术介绍

[0002]代谢组学涉及对生物样品中所有小分子化合物的全面分析，可以反应环境、基因、营养状况、药物、生理病理等诸多因素对身体的影响，并广泛用于各个研究领域，包括生命科学、临床诊断、新药研发等方面。
[0003]目前，基于质谱(MS)的靶向和非靶向代谢组学检测方法具有较高的灵敏度，在生物样品的代谢组学检测中应用广泛。但是，基于MS的代谢组学检测方法众多，跨实验室和跨平台的可比性差，限制了代谢组学研究结果的临床转化应用。因此，需要建立从数据产生到分析全流程的质量控制体系，从而保证代谢组学检测结果的可靠性。
[0004]标准物质是对代谢组学数据进行质量评估和质量控制的重要工具，可以客观地评估数据产生平台、实验室和数据分析方法的优劣。目前国际上已有一些公开可获取的代谢物标准物质，主要是美国国家标准与技术研究院(National Institute of Standards and Technology，NIST)研制的：1)NIST SRM1950人血浆标准物质，有100个代谢物采用绝对定量的方法进行了定值。2)RM 8231冷冻人血浆套件，是NIST最近开发的用于脂质组学研究质量控制的标准物质，目前还没有正式发布使用。候选RM 8231包括三种新型混合人血浆材料(糖尿病RM 8231
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1、高甘油三酯RM 8231
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2和非裔美国人RM 8231
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3)。据文献报道，其采用非靶向超高效液相色谱/串联质谱(UHPLC
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MS/MS)方法报告了候选RM8231中复杂脂质的半定量值结果。
[0005]但是，这些代谢组学标准物质用于代谢组学数据质量评估时仍然存在较大的局限性：
[0006](1)可靠的检测出生物学差异的能力是组学研究的关键目标，而基于单样本的血浆SRM 1950局限于评估技术重复样本的一致性，而缺乏对不同样本生物学差异是否能够准确检出的评估；
[0007](2)基于多样本的参考物质RM 8231，并没有开发与差异检出能力相匹配的数据质量评估指标；
[0008](3)已有血浆、血清、尿液、肝脏组织等来源的参考物质，缺乏更易复制的细胞系来源的参考物质。
[0009]综上所述，本领域仍缺乏一种能够准确有效地评估具有中国人遗传背景样本的高通量代谢组数据产生和数据分析可靠性的代谢物标准物质和标准参考数据集。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的是提供一种同卵双胞胎家系人源B淋巴细胞系代谢物标准物质及制
备方法和应用。
[0011]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案具体如下：
[0012]一种同卵双胞胎家系人源B淋巴细胞系代谢物标准物质，包括同卵双胞胎家系中父、母、子代双胞胎共4个人源B淋巴细胞系代谢物标准物质，所述人源B淋巴细胞系代谢物标准物质具体为，一套4管代谢物，分别从父、母、子代双胞胎四个细胞系中提取的总代谢物，其量值为父亲、母亲、一个子代分别与另一个子代中差异代谢物表达的比值。
[0013]其中，所述代谢物标准物质以冻干粉或溶液的形式保存。
[0014]其中，每管代谢物标准物质包含106细胞的甲醇:水为6:1的溶液提取物；按照已知摩尔量加入10个菌群代谢物和磺胺二甲氧嘧啶作为外加质控品。
[0015]本专利技术所述的同卵双胞胎家系人源B淋巴细胞系代谢物标准物质的制备方法，包括以下步骤：
[0016](1)从同卵双胞胎家系中的父、母、子代双胞胎共4份血液中获得淋巴母细胞，其中，所述父、母、子代双胞胎的4份血液样本分别记为F7、M8、D5、D6；
[0017](2)通过EBV病毒转染获得永生化的细胞系，培养细胞；
[0018](3)代谢物提取：每管代谢物标准物质包含106细胞的甲醇:水为6:1的溶液提取物；
[0019](4)按照已知摩尔量加入10个菌群代谢物和磺胺二甲氧嘧啶作为外加质控品。
[0020]本专利技术所述同卵双胞胎家系人源B淋巴细胞系代谢物标准物质的标准参考数据集，包括同卵双胞胎家系人源B淋巴细胞系代谢物标准物质的特性量值，即两两样本对之间差异表达代谢物含量的比值，D5/D6，F7/D6，M8/D6。
[0021]本专利技术所述标准参考数据集的制备方法：将同卵双胞胎家系中的D6作为分母，定义3个样本对D5/D6、F7/D6、M8/D6的比值为高置信差异代谢物的相对表达值；
[0022]具体定值流程为：
[0023]1)样本对间表达水平存在显著性差异：对于每个样本对，对每个代谢物在两个样本中的表达水平进行差异显著性检验，筛选出至少在两家实验室数据中，样本对间表达水平存在显著性差异的代谢物(t test，p<0.05)；
[0024]2)样本对的相对表达值在5家实验室检测中的代谢物比值的均值>1.2或者<0.833，且CV＜20％；计算5家实验室检出代谢物比值的平均值，定义为该样本对的高置信差异代谢物的相对表达值；
[0025]获得高置信代谢物相对表达水平的标称值；以6批高质量数据中相对表达水平的标准偏差来估计重复性引入的A类不确定度。
[0026]基于本专利技术所述标准物质和标准参考数据集进行高通量代谢组表达谱性能评价的方法：
[0027](1)基于同卵双胞胎家系B淋巴细胞系代谢物标准物质的信噪比，体现组学检测对生物学差异的区分能力，用于跨平台代谢组学检测的性能评估；
[0028](2)基于高置信参考数据集的相关性系数：通过评估与高置信参考数据集的相对表达一致性水平，反映检测结果与外部数据的一致性水平；
[0029](3)基于11种外加质控品的均方根差：基于外加已知物质的量的质控品，评估检测水平的一致性。
[0030]本专利技术技术方案的技术原理：进行代谢组分析的主要目的是发现差异代谢物，即信号值，作为临床靶向用药或治疗的靶点，因此如何排除代谢组分析中的噪音，有效区分不同样本间真正的信号，就需要有与真实样本接近的标准物质作为质控标准，基于同一标准物质不同重复和不同标准物质样本对的信噪比设定分析过程中的参数和阈值，从而保障分析结果的准确可靠。
[0031]同现有技术相比，本专利技术的突出效果在于：
[0032](1)本专利技术的同卵双胞胎家系人源B淋巴细胞系代谢物标准物质可用于对代谢组检测进行质量控制和性能评价，也可用于评估和消除多批次检测中的技术噪音，为多中心、长期大队列研究的数据整合提供质量保证。
[0033](2)本专利技术的代谢物标准物质是细胞提取物，适用于评价代谢组的上机检测及后续生物信息学分析过程，不适用于评价代谢物提取等样本前处理过程。
[0034](3)本专利技术制备的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同卵双胞胎家系人源B淋巴细胞系代谢物标准物质，其特征在于：包括从同卵双胞胎家系中父、母、子代双胞胎共4个人源B淋巴细胞系中提取的代谢物，其量值为父亲、母亲、一个子代分别与另一个子代中代谢物表达的比值。2.根据权利要求1所述的同卵双胞胎家系人源B淋巴细胞系代谢物标准物质，其特征在于：所述代谢物标准物质以冻干粉或溶液的形式保存。3.根据权利要求2所述的同卵双胞胎家系人源B淋巴细胞系代谢物标准物质，其特征在于：每管代谢物标准物质包含106细胞的甲醇:水为6:1的溶液提取物；按照已知摩尔量加入10个菌群代谢物和磺胺二甲氧嘧啶作为外加质控品。4.权利要求1
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3任一所述的同卵双胞胎家系人源B淋巴细胞系代谢物标准物质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)从同卵双胞胎家系中的父、母、子代双胞胎共4份血液中获得淋巴母细胞，其中，所述父、母、子代双胞胎的4份血液样本分别记为F7、M8、D5、D6；(2)通过EBV病毒转染获得永生化的细胞系，培养细胞；(3)代谢物提取：每管代谢物标准物质包含106细胞的甲醇:水为6:1的溶液提取物；(4)按照已知摩尔量加入10个菌群代谢物和磺胺二甲氧嘧啶作为外加质控品。5.根据权利要求4所述的同卵双胞胎家系人源B淋巴细胞系代谢物标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，通过EBV病毒转染获得永生化的细胞系的具体方法为，按照EasySep
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HumanB Cell Enrichment Kit试剂盒的操作步骤进行B细胞分选；分选得到的B细胞用含EBV病毒的完全培养基重悬；2000rpm离心感染1小时，之后放入培养箱培养；转染成功的细胞呈团簇状悬浮生长，符合EBV转染的永生化B淋巴母细胞的典型特征。6.根据权利要求5所述的同卵双胞胎家系人源B淋巴细胞系代谢物标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)具体为：每管加入2.4毫升冰水预冷的甲醇溶液，所述甲醇溶液为甲醇：水＝6:1；冰水浴超声3次，功率10％，每次超声5s，间隔1分钟；底部细胞团块被完全超声打碎，呈白色乳浊液；离心4500g，20min，4℃；取完成离心的同组细胞上清液合并于50ml离心管内，混匀，冰上暂存；下层沉淀全部保存至
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80度冰箱，然后分组依次合并上清。7.根据权利要求6所述的同卵双胞胎家系人源B淋巴细胞系代谢物标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)具体为：外源添加已知摩尔量的人源细胞系不表达的10种菌群代谢物和一种磺胺类抗生素Sulfadimethoxine，对代谢组学数据的准确性进行独立评估；取下列标准品，分别称取5mg标准品至1.5mL棕色玻璃小瓶内，各加入对应溶剂，超声或震荡使完全溶解，得到对应浓度的...

【专利技术属性】
技术研发人员：董莲华，郑媛婷，戴新华，张乃心，方向，龚晓云，杨竞成，郁颖，石乐明，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：