一种鞘磷脂转运的新检测方法技术

技术编号:36508159 阅读:13 留言:0更新日期:2023-02-01 15:34
本发明专利技术公开一种鞘磷脂转运的新检测方法。该发明专利技术包括检测不同反应条件对鞘磷脂翻转效率的影响,鞘磷脂翻转酶ATP13A2特定氨基酸位点突变对鞘磷脂翻转效率的影响。本发明专利技术从不同角度试验验证了此检测方法的可靠性,为今后的鞘磷脂的翻转检测及神经退行性疾病研究提供技术参考。技术参考。技术参考。

【技术实现步骤摘要】
一种鞘磷脂转运的新检测方法


[0001]本专利技术属于生物
,是一种鞘磷脂转运的新检测方法,此方法以鞘磷脂翻转酶ATP13A2为主要原料合成人工脂质膜为基础。

技术介绍

[0002]帕金森(Parkinson

s disease,PD)是当今发生最为广泛的一类神经退行性疾病。随着年龄增长,PD患病率逐年升高,55岁以上的人群中患病率超过1%,65岁以上高达2%。大多数病人表现为活动失调及静止时不自主的颤抖,还有许多病人表现出烦躁、抑郁或精神失常,产生巨大的经济和社会负担。
[0003]2006年,Ramirez等人报道ATP13A2基因是常染色体隐性遗传性青壮年帕金森综合征的致病基因。在青年帕金森、痴呆综合征患者中发现了多种ATP13A2基因突变。最近,基因与疾病关联性研究表明,ATP13A2基因突变与遗传性痉挛性截瘫(spastic paraplegia,SPG)有关,与神经元蜡样脂褐素病(neuronal ceroidlipofuscinoses,NCL)有关,还与肌萎缩侧索硬化症或渐冻症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)有关。但是,ATP13A2基因突变与以上这些运动性疾病的因果关系、以及如何靶向干预在防治策略方面尚不清楚。研究报道ATP13A2蛋白与细胞内脂类的稳态调节密切相关,ATP13A2蛋白N端具有磷脂酸(PA)和磷脂酰肌醇(3,5)二磷酸[PI(3,5)P2]的结合域,但是并未提出ATP13A2蛋白具有调节鞘磷脂转运和再循环的重要新功能。
[0004]鞘磷脂是神经髓鞘及细胞膜结构的主要成分,是合成鞘糖脂如脑苷脂(cerebroside)和神经节苷脂(ganglioside)、及产生其它鞘脂(如神经酰胺、鞘氨醇)的主要磷脂。目前,已知鞘磷脂由内质网合成并经高尔基体运输到细胞膜,再经溶酶体降解。但是,溶酶体内的鞘磷脂的转运、囤积紊乱和再循环利用机制还不清楚,鞘磷脂转运的检测方法还未见报道。本专利技术发现ATP13A2蛋白具有转运鞘磷脂的作用,是一种新型的鞘磷脂翻转酶,在此基础上建立了一种检测鞘磷脂翻转的新方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于针对上述现有技术中存在的问题,建立一种新的检测鞘磷脂翻转的方法,鞘磷脂翻转酶ATP12A2的基因序列和蛋白质序列如数据库Uniprot所示。
[0006]为了实现上述目的,本专利技术采用以下技术方案:
[0007]第一方面,本专利技术提供一种人工脂质膜,以鞘磷脂翻转酶ATP13A2、鞘磷脂翻转酶ATP13A2突变体、NBD荧光标记的鞘磷脂NBD SM,二油酰磷脂酰胆碱DOPC为原料,体外制备人工脂质膜。
[0008]所述人工脂质膜的具体制备如下:
[0009]S1:将4μmol二油酰磷脂酰胆碱DOPC和40nmol NBD标记的鞘磷脂SM溶解于1ml氯仿中并旋转蒸发干燥制备成多泡脂质体,经200nm聚碳酸酯过滤器处理形成大的单层囊泡,然后利用3mM正十二烷基β

麦芽糖苷DDM对单层囊泡去稳定,得到去稳定后的单层脂质体;
[0010]S2:将纯化的鞘磷脂翻转酶ATP13A2加入去稳定后的单层脂质体中得到重组混合物,常温混合15min,搅拌,每1ml重组混合物中加入0.3g湿洗过的生物珠,4℃旋转孵育16h,静置2min。
[0011]作为优选,所述重组混合物中ATP13A2蛋白质的体积为总混合物体积的10%。
[0012]作为优选,所述的NBD荧光标记的鞘磷脂为酰基链长度不同的两种鞘磷脂NBD C6

SM和NBD C12

SM。
[0013]作为优选,所述的常温为23

30℃。
[0014]第二方面,本专利技术提供一种鞘磷脂转运的检测方法,具体是:
[0015]使用鞘磷脂翻转酶ATP13A2、鞘磷脂翻转酶ATP13A2突变体、NBD荧光标记的鞘磷脂(NBD SM)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)为原料,体外制备人工脂质膜。检测不同鞘磷脂翻转酶ATP13A2剂量、底物鞘磷脂浓度和反应温度对鞘磷脂翻转效率的影响,检测ATP13A2对不同脂质底物的翻转特异性,筛选鞘磷脂翻转相关的ATP13A2特异性氨基酸位点。
[0016]作为优选,通过突变ATP13A2蛋白的氨基酸位点L247A,Y271A,V429A,A467E,L477A,D508N,H554A,S633A,Y935A,Y947A和T341A中的一个或多个调控鞘磷脂翻转活性。
[0017]作为优选,通过突变ATP13A2蛋白的氨基酸位点G499R,K509E,G528R,G872R和L1054R中的一个或多个调控鞘磷脂的翻转活性效率。
[0018]作为优选,ATP13A2蛋白浓度与鞘磷脂翻转效率呈正相关。
[0019]本专利技术的有益效果是:
[0020]本专利技术发现ATP13A2蛋白具有转运鞘磷脂的作用,是一种新型的鞘磷脂翻转酶,在此基础上建立了一种检测鞘磷脂翻转的新方法。鞘磷脂翻转酶ATP13A2具有特异性转运鞘磷脂的活性,对其他磷脂类(磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸)和神经酰胺没有转运活性。本专利技术从不同角度试验验证了此检测方法的可靠性,为今后的鞘磷脂的翻转检测及神经退行性疾病研究提供技术参考。
附图说明
[0021]图1为检测鞘磷脂翻转方法的原理图;
[0022]图2为鞘磷脂翻转酶ATP13A2对鞘磷脂翻转效率的时间曲线图;
[0023]图3为不同温度和酰基链长度的鞘磷脂对鞘磷脂翻转效率的影响图;
[0024]图4为不同浓度鞘磷脂翻转酶ATP13A2对鞘磷脂翻转效率的影响图;
[0025]图5为不同浓度鞘磷脂底物对鞘磷脂翻转效率的影响图;
[0026]图6为检测ATP13A2对不同脂类底物(磷脂酸、磷脂酰胆碱PC、磷脂酰乙醇胺PE、磷脂酰丝氨酸PS、神经酰胺Cer和鞘磷脂)的翻转特异性图;
[0027]图7为通过鞘磷脂翻转活性检测,在鞘磷脂翻转酶ATP13A2上筛选得到11个对鞘磷脂翻转有重要作用的氨基酸位点;
[0028]图8为ATP13A2上与临床Kufor

rakeb综合症相关的突变体对鞘磷脂翻转效率的影响图。
具体实施方式
[0029]下面结合实施例和附图对本专利技术进行详细描述,实施例仅用于说明本专利技术,而不
应试为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行,所用试剂或仪器未注明生成厂商者,均为可以通过市购常规产品。
[0030]实施例1:
[0031]实验对象:体外人工制备的脂质体。
[0032]实验方法:将4μmol DOPC和40nmol NBD标记的鞘磷脂SM溶解于1ml氯仿中并旋转蒸发干燥制备成多泡脂质体,经200nm聚碳酸酯过滤器处理形成大的单层囊泡。
[00本文档来自技高网
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人工脂质膜,其特征在于,以鞘磷脂翻转酶ATP13A2、鞘磷脂翻转酶ATP13A2突变体、NBD荧光标记的鞘磷脂NBD SM,二油酰磷脂酰胆碱DOPC为原料,体外制备人工脂质膜。2.根据权利要求1所述的一种人工脂质膜,其特征在于,所述人工脂质膜的具体制备如下:S1:将4μmol二油酰磷脂酰胆碱DOPC和40nmol NBD标记的鞘磷脂SM溶解于1ml氯仿中并旋转蒸发干燥制备成多泡脂质体,经200nm聚碳酸酯过滤器处理形成大的单层囊泡,然后利用3mM正十二烷基β

麦芽糖苷DDM对单层囊泡去稳定,得到去稳定后的单层脂质体;S2:将纯化的鞘磷脂翻转酶ATP13A2加入去稳定后的单层脂质体中得到重组混合物,常温混合15min,搅拌,每1ml重组混合物中加入0.3g湿洗过的生物珠,4℃旋转孵育16h,静置2min。3.根据权利要求2所述的一种人工脂质膜,其特征在于,所述重组混合物中ATP13A2蛋白质的体积为总混合物体积的10%。4.如权利要求2所述的一种人工脂质膜,其特征在于,所述的NBD荧光标记的鞘磷脂为酰基链长度不同的两种鞘磷脂NBD ...

【专利技术属性】
技术研发人员:刘俊平李建峰鲁燕华
申请(专利权)人:杭州师范大学
类型:发明
国别省市:

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