一种提高夏季水牛胚胎生产效率的方法技术

本发明专利技术公开一种提高夏季水牛胚胎生产效率的方法，属于水牛体外胚胎发育技术领域。该方法为在常规培养水牛卵母细胞的基础下，体外成熟培养液中添加氯化锂和褪黑素联合培养水牛卵母细胞，胚胎培养阶段继续添加褪黑素培养。在本发明专利技术中，研究对比夏冬季水牛胚胎体外生产效率和牛体内的褪黑素，发现夏季水牛胚胎的体外生产效率显著低于冬季，且夏季水牛血液中的褪黑素浓度显著低于冬季水牛，推定褪黑素可以影响水牛卵泡发育，进而影响卵母细胞成熟和胚胎发育。本技术方案中氯化锂作为Wnt/β

【技术实现步骤摘要】
一种提高夏季水牛胚胎生产效率的方法


[0001]本专利技术涉及水牛体外胚胎发育
，特别涉及一种提高夏季水牛胚胎生产效率的方法。

技术介绍

[0002]热应激(HS)指在高环境温度中，机体所做的非特异性的生理反应的总和。热应激对家畜生产力有负面影响，而气候变化可能会加剧这些影响，特别会降低家畜的繁殖性能。
[0003]研究表明热应激显著降低牛、山羊、绵阳、猪和小鼠的受精率、受胎率和胚胎发育效率。而卵母细胞的质量是影响受精、胚胎发育、胎儿发育以及后代健康的最主要因素。卵母细胞容易受多种环境应激影响，热应激会降低猪卵母细胞质量、第一极体排出率和早期胚胎发育潜能。热应激会引起卵母细胞的细胞核、细胞质、胞质内细胞器(如皮质颗粒和线粒体)、细胞骨架、内质网等方面的变化；并促进细胞凋亡、增加ROS、降低ATP合成、下调HSPs和线粒体相关基因。此外，热应激还会引起负责卵丘细胞和卵母细胞物质转运的跨透明带突起(TZPs)和间隙连接(GJs)的变化。卵丘细胞一般保护卵母细胞抵抗各种外界环境的干扰，然而当在热应激环境下，卵丘细胞也可能将ROS转入卵母细胞内引起卵母细胞凋亡。
[0004]通过研究发现夏季水牛卵母细胞(活体采卵获得或屠宰场卵巢获得)的成熟率、分裂率和囊胚率均显著低于冬季。可见，缓解热应激对卵丘
‑
卵母细胞复合体的影响可以提高夏季水牛胚胎生产效率进而推动水牛良种扩繁。

技术实现思路

[0005]本专利技术的主要目的是提供一种提高夏季水牛胚胎生产效率的方法，旨在使用氯化锂(Licl)与褪黑素(MT)联合使用提高夏季水牛胚胎生产效率。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供一种提高夏季水牛胚胎生产效率的方法，所述方法为：
[0007]S1，获取水牛卵丘
‑
卵母细胞复合体(COCs)；
[0008]S2，将所述水牛卵丘
‑
卵母细胞复合体放入培养液中进行体外成熟培养，所述培养液成分中含有氯化锂(LiCl)和褪黑素(MT)；
[0009]S3，取S2中进行体外成熟培养后的水牛卵丘
‑
卵母细胞复合体，转入覆盖石蜡油的IVM液微滴内培养，得到成熟水牛卵丘
‑
卵母细胞复合体；
[0010]S4，将S3中的成熟水牛卵丘
‑
卵母细胞复合体转入体外受精(IVF)液微滴中，与水牛精子共同孵育22
‑
24h完成体外受精，得到受精后的水牛卵丘
‑
卵母细胞复合体；
[0011]S5，将受精后的水牛卵丘
‑
卵母细胞复合体吹打去除卵丘细胞后，用胚胎培养液清洗，转入含卵丘细胞单层的胚胎培养液微滴进行胚胎培养，获得水牛体外生产胚胎。
[0012]可选地，所述S2中用于进行体外成熟培养的培养液包括以下成分：
[0013]体积百分比为10％的胎牛血清(FBS)、4～6ng/mL的卵泡刺激素(FSH)、8～12ng/mL的黄体生成素(LH)、0.1～0.3mM的丙酮酸钠(C3H3NaO3)、0.5～1.5μg/mL的雌二醇(E2)、45～
50μM的半胱氨酸(Cys)、20～30ng/mL的表皮生长因子(EGF)、10μM的氯化锂(Licl)；10
‑9M的褪黑素(MT)，余量为TCMl99培养基。
[0014]可选地，所述S2中用于进行体外成熟培养的培养液包括以下成分：
[0015]体积百分比为10％的胎牛血清(FBS)、5ng/mL的卵泡刺激素(FSH)、10ng/mL的黄体生成素(LH)、0.2mM的丙酮酸钠(C3H3NaO3)、1μg/mL的雌二醇(E2)、50μM的半胱氨酸(Cys)、25ng/mL的表皮生长因子(EGF)、10μM的氯化锂(Licl)；10
‑9M的褪黑素(MT)，余量为TCMl99培养基。
[0016]可选地，S5中所述胚胎培养液包括以下成分：
[0017]体积百分比为10％的胎牛血清(FBS)、10
‑9M的褪黑素(MT)，余量为TCMl99培养基。
[0018]可选地，S5中所述含卵丘细胞单层的胚胎培养液制作方法为：
[0019]取S2中卵丘细胞扩展良好进行体外成熟培养后的水牛卵丘
‑
卵母细胞复合体，转入覆盖石蜡油的40μL胚胎培养液微滴内，用100μL枪头吹打使卵丘细胞均匀分布于微滴内，培养2
‑
4天，使卵丘细胞在微滴内生长到100％汇集，得到胚胎培养用的卵丘细胞单层。
[0020]可选地，所述水牛卵丘
‑
卵母细胞复合体体外获取的方法为：从屠宰场收集卵巢，使用注射针抽取直径为2
‑
8mm的卵泡，收集卵泡液，在镜下检出水牛卵丘
‑
卵母细胞复合体。
[0021]可选地，所述水牛卵丘
‑
卵母细胞复合体体内获取的方法为：通过B超引导从活体水牛卵巢上采集直径为2
‑
8mm的卵泡的卵泡液，镜下检出水牛卵丘
‑
卵母细胞复合体。
[0022]可选地，所述提高夏季水牛胚胎生产效率的方法还包括以下步骤:
[0023]S6，在水牛体外生产胚胎过程中加入褪黑素(MT)。
[0024]本专利技术还包括一种夏季水牛胚胎，所述夏季水牛胚胎采用了上述全部技术方案进行培养。
[0025]相对现有技术，本申请具备如下有益效果：
[0026]通过研究对比夏冬季的水牛卵母细胞的胚胎生产效率和夏冬季水牛体内褪黑素(MT)水平，发现冬季水牛卵母细胞的胚胎生产效率显著高于夏季，且冬季水牛体内的褪黑素(MT)浓度显著高于夏季，推定褪黑素(MT)可以影响水牛卵泡发育，进而影响卵母细胞成熟。
[0027]研究发现，使用氯化锂(Licl)作为Wnt/β
‑
catenin信号通路激活剂对水牛体外胚胎生产效率起到了良好的促进作用。
[0028]通过添加褪黑素(MT)与氯化锂(Licl)联合培养水牛卵母细胞提高卵母细胞的成熟率、胚胎分裂率、囊胚率和胚胎质量，从而提高夏季水牛胚胎的体外生产效率。
附图说明
[0029]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
[0030]图1为专利技术提出的一种提高夏季水牛胚胎生产效率方法的流程图；
[0031]图2为夏冬季水牛血液中褪黑素含量的对比图(水牛总体在夏冬季的褪黑素水平比较)；
[0032]图3为夏冬季水牛血液中褪黑素含量的对比图(水牛个体在夏冬季的褪黑素水平比较)；
[0033]图4氯化锂与褪黑素联合培养对热应激水牛卵母细胞成熟率的影响散点统计图
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高夏季水牛胚胎生产效率的方法，其特征在于，所述方法为：S1，获取水牛卵丘
‑
卵母细胞复合体(COCs)；S2，将所述水牛卵丘
‑
卵母细胞复合体放入培养液中进行体外成熟培养，所述培养液成分中含有氯化锂(LiCl)和褪黑素(MT)；S3，取S2中进行体外成熟培养后的水牛卵丘
‑
卵母细胞复合体，转入覆盖石蜡油的IVM液微滴内培养，得到成熟水牛卵丘
‑
卵母细胞复合体；S4，将S3中的成熟水牛卵丘
‑
卵母细胞复合体转入体外受精(IVF)液微滴中，与水牛精子共同孵育22
‑
24h完成体外受精，得到受精后的水牛卵丘
‑
卵母细胞复合体；S5，将受精后的水牛卵丘
‑
卵母细胞复合体吹打去除卵丘细胞后，用胚胎培养液清洗，转入含卵丘细胞单层的胚胎培养液微滴进行胚胎培养，获得水牛体外生产胚胎。2.如权利要求1所述的一种提高夏季水牛胚胎生产效率的方法，其特征在于，所述S2中用于进行体外成熟培养的培养液包括以下成分：体积百分比为10％的胎牛血清(FBS)、4～6ng/mL的卵泡刺激素(FSH)、8～12ng/mL的黄体生成素(LH)、0.1～0.3mM的丙酮酸钠(C3H3NaO3)、0.5～1.5μg/mL的雌二醇(E2)、45～50μM的半胱氨酸(Cys)、20～30ng/mL的表皮生长因子(EGF)、10μM的氯化锂(Licl)；10
‑9M的褪黑素(MT)，余量为TCMl99培养基。3.如权利要求2所述的一种提高夏季水牛胚胎生产效率的方法，其特征在于，所述S2中用于进行体外成熟培养的培养液包括以下成分：体积百分比为10％的胎牛血清(FBS)、5ng/mL的卵泡刺激素(FSH)、10ng/mL的黄体生成素(LH)、0.2mM的丙酮酸钠(C3H3NaO3)、1μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨春艳，尚江华，郑海英，
申请(专利权)人：广西壮族自治区水牛研究所，
类型：发明
国别省市：