一种检测中和抗体的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测中和抗体的方法。所述的方法包括如下步骤：(1)将病原微生物受体结合域抗原修饰的编码磁珠与生物素标记的病原微生物受体以及待测样品进行混合、孵育，得孵育产物1；(2)将所述孵育产物1与链霉亲和素

【技术实现步骤摘要】
一种检测中和抗体的方法


[0001]本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种检测中和抗体的方法。

技术介绍

[0002]疫苗是预防细菌病毒感染的重要手段之一。中和抗体是一种人体免疫系统产生，能够阻碍入侵的细菌或病毒感染人体。因此，测量体内中和抗体的效果是评估疫苗接种后有效性的主要方法。中和抗体的主要检测方法是利用抗原抗体的特异性结合和阻断感染的原理，通过显色反应或荧光强弱的变化来测量中和抗体浓度的高低。酶联免疫吸附剂测定(ELISA)是中和抗体检测的常用方法之一，具有很好的灵敏度和检测稳定性，搭配自动化仪器也能实现高通量样本检测。但是对于大量样本的筛查工作，单孔单样本的检测方法限制了检测的灵活性和检测通量。
[0003]现有的ELISA方法利用病毒蛋白
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受体蛋白之间的相互作用，模拟活细胞感染病毒，通过显色反应来判断结果。当人体被2019
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nCoV感染未产生中和抗体时，酶标记的RBD蛋白片段就会与受体蛋白ACE
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2相结合，如果机体被2019
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nCoV感染产生中和抗体时，就会阻断RBD蛋白片段与受体蛋白ACE
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2相结合，从而导致显色减弱，与中和抗体有无呈负相关，通过校准品曲线可计算中和抗体的浓度。然而现有的ELISA方法有诸多缺陷：1)在一个反应孔内对单靶标进行检测，不能对多靶标同时检测；2)在一个反应孔内只能检测一个患者样本，不能对多个患者样本同时检测；3)现有ELISA方法的检测时间较长，由于孵育步骤较多，总体时间通常要2h以上(例如：加待检测样10分钟、孵育30min、洗涤10min、加标记抗体，孵育30min、洗涤10min、加染料孵育30min、洗涤10min，放机器里读数)；4)现有ELISA方法只能验证患者体内中和抗体对一种病毒阻断抑制效果，无法同时评估突变类型的阻断效果。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是为克服现有技术中抗体进行检测时存在的效率低下的缺陷，提供一种利用编码磁珠特别是数字编码磁珠对多样本中和抗体同时检测的方法。通过编码的磁珠也能对多靶标的中和抗体进行检测，大大的提高了检测的灵活性和检测通量，对于大样本的筛查有很大帮助。
[0005]本专利技术主要通过以下技术方案解决上述技术问题。
[0006]本专利技术提供一种检测待测样品中病原微生物中和抗体的方法，所述的方法包括如下步骤：
[0007](1)将病原微生物受体结合域抗原修饰的编码磁珠与生物素标记的病原微生物受体以及待测样品进行混合、孵育，得孵育产物1；
[0008](2)将所述孵育产物1与链霉亲和素
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荧光染料混合、孵育，得孵育产物2；
[0009](3)清洗所述孵育产物2并进行荧光强度分析、根据标准曲线计算待测样品中中和抗体的浓度。
[0010]步骤(1)中所述生物素标记的病原微生物受体的使用浓度较佳地为0.1μg/mL～
100μg/mL。
[0011]步骤(1)中所述孵育的时间较佳地为1min～60min，优选20min。
[0012]步骤(1)中所述病原微生物受体结合域抗原较佳地为新冠受体结合域抗原。
[0013]步骤(2)中所述链霉亲和素
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荧光染料的用量优选依据步骤(1)中所述生物素标记的病原微生物受体的用量而定，所述生物素标记的病原微生物受体和所述链霉亲和素
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荧光染料的质量比较佳地为5:6；
[0014]步骤(2)中所述孵育的时间较佳地为20min。
[0015]步骤(3)较佳地进一步包括：明场拍照，得到每种磁珠的编码信息，然后和荧光照片信息合并，得到不同样本或待测物的中和抗体信息。
[0016]在本专利技术一优选实施方案中，步骤(1)中先将所述生物素标记的血管紧张素转化酶2与所述待测样品孵育1min
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60min后，再与病原微生物受体结合域抗原修饰的编码磁珠进行混合、孵育。
[0017]步骤(1)中所述病原微生物受体结合域抗原修饰的编码磁珠可为本领域常规，其制备方法包括如下步骤：
[0018]a).使用反应物NHS/EDC处理编码磁珠；
[0019]b).加入病原微生物受体结合域抗原、孵育，得抗原修饰的编码磁珠。
[0020]其中，所述NHS(N
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羟基琥珀酰亚胺)和所述EDC(1
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(3
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二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐)的用量摩尔比较佳地为1:10～10:1，两者浓度优选分别为5～500mg/mL，更优选均为20mg/mL。
[0021]以上步骤a)中所述处理的时间较佳地为10～60min，优选30min。
[0022]步骤b)中所述孵育的时间较佳地为14
‑
22小时。
[0023]本专利技术中所用荧光染料较佳地为异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)或者AlexaFluor系列染料。
[0024]所述编码磁珠可为本领域常规，例如数字编码磁珠、荧光编码磁珠、条形码编码磁珠或者结构编码磁珠；所述数字编码磁珠具有多种编码图案，每种图案标记一种样本或一种中和抗体。
[0025]此外，本专利技术中步骤(3)中所述标准曲线的建立包括如下步骤：
[0026]1)将病原微生物受体结合域抗原修饰的编码磁珠与生物素标记的病原微生物受体以及一系列浓度梯度的待检测中和抗体进行混合、孵育，得孵育产物1；
[0027]2)将所述孵育产物1与链霉亲和素
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荧光染料混合、孵育，得孵育产物2。
[0028]本专利技术还提供编码磁珠在竞争法检测抗体中的应用；所述编码磁珠优选数字编码磁珠、荧光编码磁珠、条形码编码或者结构编码磁珠。
[0029]如上所述，所述数字编码磁珠具有多种编码图案，每种图案标记一种样本或一种中和抗体。
[0030]利用数码磁珠对抗体类检测的通用流程：首先将抗原修饰在数码磁珠上，通过免疫反应对待测物进行捕获，然后通过生物素修饰的另一个抗体对检测物进行结合，并且加入链霉亲和素修饰的荧光基团，使荧光基团结合在待测物上(如图1所示)。最后进行拍照，可以先在白光下获得磁珠编码，再利用激光激发测荧光强度，或者先检测荧光强度，在进行明场拍照，得到待测物的荧光值和磁珠编码信息，和标准曲线进行对比，计算待测物浓度。
[0031]通过具有不同编码信息的数码磁珠对待测样本进行孵育后，检测的荧光强度可对应到相应编码信息，从而获得对应荧光值下的样本信息。当多靶标样本或者多患者样本混合检测时，通过磁珠上的编码信息进行患者区分。因此可以进行多靶标检测和多患者同时检测。
[0032]如本示例方法中对多患者模拟样本的新冠中和抗体的抑制效果进行检测，将新冠抗原通过新冠受体结合域抗原(RBD)上氨基和数码磁珠上的羧基进行偶联反应，使新本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测待测样品中病原微生物中和抗体的方法，其特征在于，其包括如下步骤：(1)将病原微生物受体结合域抗原修饰的编码磁珠与生物素标记的病原微生物受体以及待测样品进行混合、孵育，得孵育产物1；(2)将所述孵育产物1与链霉亲和素
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荧光染料混合、孵育，得孵育产物2；(3)清洗所述孵育产物2并进行荧光强度分析、根据标准曲线计算待测样品中中和抗体的浓度。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述生物素标记的病原微生物受体的使用浓度为0.1μg/mL～100μg/mL；和/或，步骤(1)中所述孵育的时间为1min～60min，优选20min；和/或，步骤(1)中所述病原微生物受体结合域抗原为新冠受体结合域。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述链霉亲和素
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荧光染料的用量依据步骤(1)中所述生物素标记的病原微生物受体的用量而定，所述生物素标记的病原微生物受体和所述链霉亲和素
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荧光染料的质量比优选5:6；和/或，步骤(2)中所述孵育的时间为20min；和/或，步骤(3)进一步包括：明场拍照，得到每种磁珠的编码信息，然后和荧光照片信息合并，得到不同样本或待测物的中和抗体信息。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述荧光染料为异硫氰酸荧光素或者AlexaFluor系列染料；和/或，所述编码磁珠为数字编码磁珠、荧光编码磁珠、条形码编码磁珠或者结构编码磁珠；较佳地，所述数字编码磁珠具有多种编码图案，每种图案标记一种样本或一种中和抗体。5.如权利要求1～4任一项所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄硕，王其伟，
申请(专利权)人：武汉华大智造科技有限公司，
类型：发明
国别省市：