一种固定化多酶材料及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种固定化多酶材料及其制备方法和应用，固定化多酶材料包括第一酶、第二酶和第三酶，第一酶与第二酶固定于ZIF

【技术实现步骤摘要】
一种固定化多酶材料及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于酶催化和酶固定化
，具体涉及一种固定化多酶材料及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]糖类化合物是一类重要的信息分子，广泛参与病原体感染、免疫应答、细胞信号转导、细胞分裂和分化、炎症反应、精卵识别和肿瘤转移等生命过程。另一方面，糖类也是重要的药用分子，比如被广泛应用于疾病治疗和预防的抗凝药肝素、氨基糖苷类抗生素以及细菌多糖结合疫苗等。此外，糖类还常作为“手性池”起始原料，用于合成具有重要生物活性及应用价值的天然产物或医药中间体。目前国内外合成糖类最常用的为化学法合成、发酵法和酶法合成。在糖类合成中，化学催化通常涉及活化、保护、糖基化和脱保护多个步骤，过程繁琐收率较低，并存在试剂价格昂贵，环境污染等问题。全细胞发酵方式可以实现规模化生产，然而由于复杂的合成代途径，多步骤代谢的协调和代谢流的调控难度大。相比之下，酶催化反应同时具有高效简便、立体专一性强、区域选择性好、反应条件温和、对环境友好等优点。在实际应用中，自由溶液状态的酶存在后续分离困难、难回收和反复使用、稳定性差等缺点。与此同时，糖类结构繁多，其物质转化和能量代谢需多种酶共同参与协同完成，关键酶之间反应条件兼容性的问题，限制了整体的催化效率。此外，糖类体外多酶催化会受到底物浓度限制，难以适应工业应用上的高浓度底物环境。近年来随着模拟生物学和工业生物催化等飞速发展，构建理想化体外多酶级联反应体系以深入探究生物复杂功能并开发新的绿色高效催化方法已成为科研工作者面临的重大挑战之一。因此急需开发一种应用于多酶级联的固定化策略以增强使酶分子稳定性，发挥不同酶之间协同催化的性能的同时，能够兼具稳定性、易储存、能重复使用和可连续化操作等优势。另一方面，由于实际应用中糖类的多样性和多酶催化体系复杂性，该策略应当具有通用性、普适性，能够广泛应用于不同多酶级联催化体系的有效固定，并且够解决一些糖类体外酶催化合成在工业化应用中的问题。

技术实现思路

[0003]专利技术目的：本专利技术提供了一种固定化多酶材料，该固定化多酶材料可显著提升多酶级联反应催化效率，可以增强多酶稳定性，实现酶的可回收利用，降低生产成本。与此同时，该固定化材料能够应用于高浓度底物催化反应，具有极大的工业应用潜力。特别地，利用该固定化多酶材料的固定化策略对不同类别的多酶催化体系具有普适性。
[0004]本专利技术还提供所述固定化多酶材料的制备方法和应用。
[0005]技术方案：为了实现上述目的，本专利技术所述一种固定化多酶材料，包括第一酶、第二酶和第三酶，所述第一酶与第二酶固定于ZIF
‑
90内部，所述第三酶固定于ZIF
‑
90表面；所述第一酶为N
‑
乙酰氨基己糖1
‑
位激酶，所述第二酶为尿苷转移酶，所述第三酶包括聚磷酸激酶、肝素合酶、透明质酸合酶、软骨素聚合酶、N
‑
乙酰氨基葡萄糖转移酶中的任意一种或
者几种。
[0006]本专利技术所述的固定化多酶材料的制备方法，包括如下步骤：
[0007](1)将含有第一酶和第二酶的混合酶液倒入咪唑
‑2‑
甲醛溶液中混合均匀；迅速加入硝酸锌溶液，搅拌反应后用去离子水洗涤，离心分离，得到双酶@ZIF
‑
90；
[0008](2)将含氨基配体的溶液与双酶@ZIF
‑
90均匀混合，水浴加热，水洗固体至上清液澄清，离心得到双酶@ZIF
‑
90
‑
NH2；
[0009](3)将双酶@ZIF
‑
90
‑
NH2与NHS
‑
PEG
n
‑
NHS和第三酶混合反应，固液分离后，收集固体产物三酶@ZIF
‑
90即为固定化多酶材料。
[0010]其中，步骤(1)中所述硝酸锌溶液和咪唑
‑2‑
甲醛母液浓度分别为80～160mM和160～320mM，硝酸锌和咪唑
‑2‑
甲醛的终浓度之比为1：2～1：6。
[0011]作为优选，硝酸锌和咪唑
‑2‑
甲醛的在体系中的最终摩尔比为1：4。
[0012]其中，步骤(2)中所述含氨基配体的溶液为含氨基配体的Tris
‑
HCl溶液；所述氨基配体为3
‑
氨基
‑
1，2，4
‑
三氮唑、2
‑
氨基苯并咪唑、6
‑
氨基嘌呤和2'
‑
氨基
‑
[1，1':4'，1
”‑
三联苯]‑
4，4
”‑
二羧酸盐中的任意一种，配制的母液浓度为20～80mM。
[0013]其中，所述氨基配体溶液是将氨基配体溶解于pH 7～8、浓度为50～100mM的Tris
‑
HCl缓冲液配制而成。
[0014]其中，步骤(2)所述水浴加热为40～50℃水浴加热搅拌0.5～1h，转速为100～200rpm。
[0015]其中，步骤(3)所述NHS
‑
PEG
n
‑
NHS中n＝3～200，NHS
‑
PEG
n
‑
NHS的浓度为20～80mM。
[0016]其中，所述第一酶、第二酶、第三酶浓度之比为1：1：1～1：1：4，在体系中终均浓度为0.5～2mg/mL。
[0017]作为优选，所述第一酶、第二酶、第三酶浓度之比为1：1：1
[0018]作为优选，所述固定化三酶级联体系的制备包括如下步骤：
[0019](1)将含有0.5～2mg/mL第一酶和0.5～2mg/mL第二酶的混合酶液倒入160～320mM咪唑
‑2‑
甲醛溶液中混合均匀；迅速加入等体积的80～160mM硝酸锌溶液搅拌反应0.5～1h，转速为100～200rpm，去离子水洗涤，8,000～12,000rpm转速离心5～10min，得到双酶@ZIF
‑
90。
[0020](2)配制浓度为20～80mM的氨基配体的Tris
‑
HCl溶液，将氨基配体溶液与上述得到的双酶@ZIF
‑
90均匀混合，40～50℃水浴加热搅拌0.5～1h，转速为100～200rpm，去离子水洗固体至上清液澄清，8,000～12,000rpm转速离心5～10min得到双酶@ZIF
‑
90
‑
NH2。
[0021](3)将上述得到的双酶@ZIF
‑
90
‑
NH2与20～80mM的NHS
‑
PEG
n
‑
NHS溶液和0.5～2mg/mL的第三酶均匀混合，交联0.5～1h，去离子水洗涤3次，6,000～本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种固定化多酶材料，其特征在于，包括第一酶、第二酶和第三酶，所述第一酶与第二酶固定于ZIF
‑
90内部，所述第三酶固定于ZIF
‑
90表面；所述第一酶为N
‑
乙酰氨基己糖1
‑
位激酶，所述第二酶为尿苷转移酶，所述第三酶包括聚磷酸激酶、肝素合酶、透明质酸合酶、软骨素聚合酶、N
‑
乙酰氨基葡萄糖转移酶中的任意一种或者几种。2.一种权利要求1所述的固定化多酶材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将含有第一酶和第二酶的混合酶液倒入咪唑
‑2‑
甲醛溶液中混合均匀；迅速加入硝酸锌溶液，搅拌反应后用去离子水洗涤，离心分离得到双酶@ZIF
‑
90；(2)将含氨基配体的溶液与双酶@ZIF
‑
90均匀混合，水浴加热，水洗固体至上清液澄清，离心得到双酶@ZIF
‑
90
‑
NH2；(3)将双酶@ZIF
‑
90
‑
NH2与NHS
‑
PEG
n
‑
NHS和第三酶混合反应，固液分离后，收集固体产物三酶@ZIF
‑
90即为固定化多酶材料。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述硝酸锌溶液和咪唑
‑2‑
甲醛母液浓度分别为80～160mM和160～320mM，硝酸锌和咪唑
‑2‑
甲醛的在体系中的最终摩尔比为1：2～...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄和，张幸，郑洁，徐涵，李昺之，林雅玫，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：