一种生物标本中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的检测方法技术

本发明专利技术提供一种生物标本中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的检测方法，包括如下步骤：a)将生物标本分为组织标本和体液样本；将组织标本碱化后冻干、酸化、液液萃取，获得第一提取液；将体液样本采用乙腈沉淀蛋白后取上清液，获得第二提取液；b)将第一提取液和/或第二提取液浓缩、复溶后加入衍生化溶液进行化学衍生化，获得样品溶液；c)将样品溶液添加衍生化内标作为标记，采用气相色谱

【技术实现步骤摘要】
一种生物标本中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的检测方法


[0001]本专利技术属于生物样本中成分检测的
，涉及一种生物标本中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的检测方法，具体涉及一种基于稳定同位素标记GC
‑
MS技术检测生物标本中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的方法。

技术介绍

[0002]短链脂肪酸(short
‑
chain fatty acids，SCFA)通常是指碳原子数小于6的有机脂肪酸，由难消化的膳食纤维在肠道菌群作用下发酵产生，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸及其衍生物等。近年来，大量研究表明SCFAs在多种生理和病理过程中均发挥重要作用，包括维持先天性肠道屏障功能，影响血脑屏障和神经免疫内分泌功能，调节免疫功能等。不仅如此，一些支链脂肪酸和羟基化的短链脂肪酸也被证明是多种复杂疾病(包括结肠炎、肥胖、代谢综合征和感染)的潜在诊断标志物。
[0003]目前已有多种方法用于定量分析生物样本中的短链脂肪酸，包括气相色谱、核磁共振和高效液相色谱等。现有技术中，中国申请专利CN111239291A提供了一种基于GC
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MS的小鼠肠
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脑轴相关组织样本中短链脂肪酸的检测方法。以脑组织、结肠组织、结肠内容物和粪便为样本，向组织样本中加入预冷的超纯水，低温下研磨均匀，然后经过涡旋、超声提取、离心，取上清液即得提取液；向各个提取液中加入内标物2
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乙基丁酸，并进行衍生化反应；衍生化后溶液分别经过萃取后，利用GC
‑
MS对各个萃取液中的乙酸、丙酸和丁酸进行检测。该方法具有前处理简便，适用于脑肠轴相关组织等特点。然而，生物样本组织中水含量变化巨大，且仅使用2
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乙基丁酸作为单一内标试剂，极易产生分析误差，难以满足临床检验高准确度、高精密度要求。

技术实现思路

[0004]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种生物标本中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的检测方法，基于同位素标记GC
‑
MS测定生物标本中19种短链脂肪酸及其羟基化衍生物含量的方法，该方法提高了短链脂肪酸及其羟基化衍生物的定量分析准确度、紧密度以及灵敏度。
[0005]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种生物标本中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的检测方法，包括如下步骤：
[0006]a)将生物标本分为组织标本和体液样本；将组织标本碱化后冻干、酸化、液液萃取，获得第一提取液；将体液样本采用乙腈沉淀蛋白后取上清液，获得第二提取液；
[0007]b)将第一提取液和/或第二提取液浓缩、复溶后加入含N
‑
甲基苄胺
‑
d0作为标记的衍生化溶液进行化学衍生化，获得样品溶液；
[0008]c)将样品溶液添加含N
‑
甲基苄胺
‑
d3的衍生化内标作为标记，采用气相色谱
‑
质谱联用法(GC
‑
MS)进行测定，确定样品溶液中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的含量。
[0009]较佳地，所述短链脂肪酸及其羟基化衍生物选自甲酸、醋酸、丙酸、正丁酸、异丁
酸、2
‑
甲基丁酸、乳酸、羟基乙酸、异戊酸、2
‑
甲基戊酸、2
‑
羟基丁酸、3
‑
甲基戊酸、2
‑
羟基
‑3‑
甲基丁酸、3
‑
羟基丁酸、β
‑
羟基异戊酸、己酸、2
‑
羟基
‑2‑
甲基丁酸、2
‑
羟基
‑4‑
甲基戊酸、正庚酸中的任一种或多种。
[0010]优选地，所述短链脂肪酸及其羟基化衍生物共19种，包括有甲酸、醋酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、2
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甲基丁酸、乳酸、羟基乙酸、异戊酸、2
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甲基戊酸、2
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羟基丁酸、3
‑
甲基戊酸、2
‑
羟基
‑3‑
甲基丁酸、3
‑
羟基丁酸、β
‑
羟基异戊酸、己酸、2
‑
羟基
‑2‑
甲基丁酸、2
‑
羟基
‑4‑
甲基戊酸、正庚酸。
[0011]较佳地，步骤a)中，所述生物标本为常规使用的生物标本。
[0012]较佳地，步骤a)中，所述组织标本包括且不限于人或动物的粪便、脑组织、肠组织。即所述组织标本选自人或动物的粪便、脑组织、肠组织中一种或多种组合。
[0013]较佳地，步骤a)中，所述体液样本包括且不限于人或动物的血浆、尿液。即所述体液样本选自人或动物的血浆、尿液中一种或多种组合。
[0014]较佳地，步骤a)中，所述碱化是在组织标本中加入碱液，所述碱液为碳酸钠溶液。
[0015]优选地，所述碳酸钠溶液为碳酸钠的水溶液，所述碳酸钠溶液的浓度为40
‑
60μg/mL，优选为50μg/mL。
[0016]优选地，所述组织标本加入质量与碱液加入体积之比为300
‑
500:400
‑
600，优选为400:500，mg/μL。
[0017]较佳地，步骤a)中，所述冻干的时间为6
‑
8h。所述冻干为冷冻干燥。
[0018]较佳地，步骤a)中，所述冻干的温度为
‑
80
‑‑
60℃。
[0019]较佳地，步骤a)中，所述组织标本冻干后要进行准确称量。便于获得组织标本的准确质量，进行后续定量处理。
[0020]较佳地，步骤a)中，所述酸化是在冻干后的组织标本中加入酸液，所述酸液为盐酸溶液。
[0021]优选地，所述盐酸溶液为浓度为4
‑
6M(mol/L)盐酸水溶液。
[0022]优选地，所述组织标本加入的质量与酸液加入体积之比为40
‑
60:205
‑
415，优选为50:310，mg/μL。
[0023]较佳地，步骤a)中，所述液液萃取采用的萃取试剂为乙醚。所述乙醚为无水乙醚。
[0024]较佳地，步骤a)中，所述液液萃取中，所述组织标本加入的质量与萃取试剂加入的体积之比为40
‑
60:50
‑
150，优选为50:100，mg/μL。
[0025]所述液液萃取为常规使用的液液萃取，即在样品中加入萃取试剂混合后形成分层，取溶剂层为第一提取液。在液液萃取过程中，可采用萃取试剂对固体层进行多次洗涤，并将洗涤液与溶剂层合并。
[0026]较佳地，步骤a)中，所述体液样本加入质量与乙腈加入体积之比为1:2
‑
4，优选为1:3，g/mL。
[0027]针对体液样本采用乙腈沉淀蛋白为常规使用的乙本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物标本中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的检测方法，包括如下步骤：a)将生物标本分为组织标本和体液样本；将组织标本碱化后冻干、酸化、液液萃取，获得第一提取液；将体液样本采用乙腈沉淀蛋白后取上清液，获得第二提取液；b)将第一提取液和/或第二提取液浓缩、复溶后加入含N
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甲基苄胺
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d0作为标记的衍生化溶液进行化学衍生化，获得样品溶液；c)将样品溶液添加含N
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甲基苄胺
‑
d3的衍生化内标作为标记，采用气相色谱
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质谱联用法进行测定，确定样品溶液中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的含量。2.根据权利要求1所述的一种生物标本中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的检测方法，其特征在于，所述短链脂肪酸及其羟基化衍生物选自甲酸、醋酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、2
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甲基丁酸、乳酸、羟基乙酸、异戊酸、2
‑
甲基戊酸、2
‑
羟基丁酸、3
‑
甲基戊酸、2
‑
羟基
‑3‑
甲基丁酸、3
‑
羟基丁酸、β
‑
羟基异戊酸、己酸、2
‑
羟基
‑2‑
甲基丁酸、2
‑
羟基
‑4‑
甲基戊酸、正庚酸中的任一种或多种。3.根据权利要求1所述的一种生物标本中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的检测方法，其特征在于，步骤a)包括以下条件中的任一项或多项：A1)所述组织标本选自人或动物的粪便、脑组织、肠组织中一种或多种组合；A2)所述体液样本选自人或动物的血浆、尿液中一种或多种组合；A3)所述碱化是在组织标本中加入碱液，所述碱液为碳酸钠溶液；A4)所述冻干的时间为6
‑
8h；A5)所述冻干的温度为
‑
80
‑‑
60℃：A6)所述酸化是在冻干后的组织标本中加入酸液，所述酸液为盐酸溶液；A7)所述液液萃取采用的萃取试剂为乙醚；A8)所述液液萃取中，所述组织标本加入的质量与萃取试剂加入的体积之比为40
‑
60:50
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150，mg/μL；A9)所述体液样本加入质量与乙腈加入体积之比为1:2
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4，g/mL。4.根据权利要求3述的一种生物标本中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的检测方法，其特征在于，还包括以下条件中的任一项或多项：A31)在A3)中，所述碳酸钠溶液为碳酸钠的水溶液，所述碳酸钠溶液的浓度为40
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60μg/mL；A32)在A3)中，所述组织标本加入质量与碱液加入体积之比为300
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500:400
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600，mg/μL；A61)在A6)中，所述盐酸溶液为浓度为4
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6M盐酸水溶液；A62)在A6)中，所述组织标本加入的质量与酸液加入体积之比为40
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60:205
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415，mg/μL。5.根据权利要求1所述的一种生物标本中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的检测方法，其特征在于，步骤b)包括以下条件中的任一项或多项：B1)所述浓缩为吹氮...

【专利技术属性】
技术研发人员：周宏伟，夏方博，崔鹏，
申请(专利权)人：南方医科大学珠江医院，
类型：发明
国别省市：