本发明专利技术公开了一种直接靶板微滴生长装置及其使用方法，直接靶板微滴生长装置，包括：底座，包括靶板托槽和环形水槽，环形水槽围绕靶板托槽；靶板，位于靶板托槽内，且靶板的一侧面设置有多个疏水环；密封垫，与所述靶板的一侧面贴合，密封垫包括与环形水槽对应的第一水槽孔和与多个疏水环对应的多个第一疏水孔；孔槽板，位于密封垫之上，包括与第一水槽孔对应的第二水槽孔和与多个第一疏水孔对应的多个第二疏水孔，使环形水槽、第一水槽孔和第二水槽孔组成水槽孔，使多个疏水环、多个第一疏水孔和多个第二疏水孔组成加样孔；顶盖，位于所述孔槽板之上，与底座卡合。通过本发明专利技术公开的直接靶板微滴生长装置，能够缩短微生物鉴定和药敏检测时间。敏检测时间。敏检测时间。
【技术实现步骤摘要】
一种直接靶板微滴生长装置及其使用方法
[0001]本专利技术涉及检测
，具体为一种直接靶板微滴生长装置及其使用方法。
技术介绍
[0002]基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix
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assisted laser desorption/ionization time
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of
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flight mass spectrometry，MALDI
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TOF MS)是一种软电离质谱技术，具有快速、稳定、灵敏、准确、分辨率高和成本低等特点。临床微生物实验室引入MALDI
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TOF MS，当前主要用于细菌和真菌的快速鉴定。其鉴定原理为：激光照射微生物样品与基质形成的共结晶，基质吸收激光能量后使微生物样品所含的生物分子(主要是蛋白质)发生电离，带电生物分子在高压电场的作用下获能、加速、聚焦，其到达TOF分析器的时间与质量成正比，以质荷比(m/z)为横坐标、离子峰为纵坐标形成特异性的生物分子指纹图谱，通过与图谱库比对，匹配出鉴定结果。MALDI
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TOF MS进行微生物鉴定仅需3～5分钟，而传统的生化鉴定卡则需数小时至十几小时不等。
[0003]感染性疾病能否得到及时有效的治疗，不仅取决于致病微生物的鉴定速度，更受限于药敏检测速度。当前，微生物药敏检测方法主要有：体外抗菌药物敏感试验(antimicrobial susceptibility testing，AST)、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)、MALDI
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TOF MS和基于MALDI
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TOF MS的直接靶板微滴生长法(direct
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on
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target microdroplet growth assay，DOT
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MGA)。AST是国际标准化组织(international organization for standardization，ISO)、临床和实验室标准化研究所(clinical and laboratory standards institute，CLSI)和欧洲抗菌药物敏感试验委员会(european committee on antimicrobial susceptibility testing，EUCAST)推荐的参考方法，在体外测试药物的杀菌或抑菌能力，包括扩散法、稀释法、抗生素浓度梯度法和自动化仪器法等，优点是能够检出未知机制耐药，缺点是耗时较长，通常在第二天才能获得药敏结果，并且无法分辨微生物纯度。PCR通过使用特异性引物快速检测特定的耐药基因，缺点是无法检出未知基因或未知机制耐药，耐药基因与耐药表型有时并不一致。MALDI
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TOF MS药敏检测分为三大类。(1)直接快速检测特定耐药机制的相关生物分子，如碳青霉烯酶、β
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内酰胺酶等，缺点是无法检出未知机制耐药。(2)对比与待测菌株共孵育前后的抗生素MALDI
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TOF MS指纹图谱，指纹图谱的变化说明水解酶的产生，优点是能够检出各种水解酶耐药，缺点是操作步骤繁琐，无法检出非水解酶耐药。(3)基于MALDI
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TOF MS的DOT
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MGA，能够在一个平台上同时完成微生物的快速鉴定和AST，兼具二者的优点，规避了传统AST无法分辨待测微生物纯度的缺点。
[0004]现有技术中，Rapid detection of antibiotic resistance by MALDI
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TOF mass spectrometry using a novel direct
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on
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target microdroplet growth assay.Clin Microbiol Infect,2018 24(7):738
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743，首次采用基于MALDI
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TOF MS的DOT
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MGA快速检测了24株肺炎克雷伯菌和24株铜绿假单胞菌对美罗培南的耐药性。具体操作步骤如下：
[0005](1)挑取新鲜菌落配制0.5麦氏浊度待测菌悬液，用CAMHB肉汤，1：100稀释至1
×
106CFU/mL。
[0006](2)用CAMHB肉汤溶解美罗培南，并调节其浓度至4μg/mL。
[0007](3)将稀释后的菌液与美罗培南溶液等体积混合于一次性MALDI
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TOF MS靶板的亲水性靶环内，形成微滴。药敏环内微滴的菌液终浓度为5
×
105CFU/mL，美罗培南溶液终浓度为2μg/mL。同时，设置生长对照环，即等体积稀释后的菌液和不含药物的CAMHB肉汤，微滴的菌液终浓度亦为5
×
105CFU/mL。实验中测试了5种不同体积的微滴，包括2μL、4μL、6μL、8μL和10μL。
[0008](4)将靶板置于配属的塑料转运盒(布鲁克道尔顿公司)内，盒子的底部加入4mL水，充当湿盒以防微滴在孵育过程中蒸发，36℃、空气中孵育。肺炎克雷伯菌，孵育3小时、4小时和18小时；铜绿假单胞菌，孵育4小时、5小时和18小时。
[0009](5)将低尘擦拭纸巾(KIMTECH Science，金佰利公司，美国佐治亚州罗斯威尔)折叠后，从底部侧方“轻触”微滴，利用毛细管效应快速除去液体，避免肉汤成分干扰分析。随后，进行标准化的MALDI
‑
TOF MS操作。
[0010](6)使用MALDI Biotyper 3.1软件(布鲁克道尔顿公司)鉴定各靶环内的微生物种属。生长对照环内，种属鉴定成功(评分≥1.7)，测试有效。药敏环内，种属鉴定成功(评分≥1.7)，为耐药菌株；反之，为非耐药菌株。
[0011]结果显示：
①
6μL的微滴对肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌均达到最佳测定性能；
②
6μL的微滴体系下，肺炎克雷伯菌孵育4小时，生长对照环内的检出率为100％；
③
6μL的微滴体系下，铜绿假单胞菌孵育4小时的检出率只有54.2％，5小时的检出率提高至83.3％；
④
细菌直接在靶板上孵育生长、使用低尘擦拭纸巾“轻触”微滴去除肉汤、截留菌体，是确保测试有效的必要条件；
⑤
靶板外孵育后再以微滴的形式转移到靶板上，立即去除肉汤，生长对照环内无法检出；再次短时间孵育(15～60分钟)后去除肉汤，生长对照环内的检出率与孵育时间成正比。分析原因，DOT
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MGA的MALDI
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TOF MS评分很可能与靶环内表面的菌膜形成量密切相关，而与微滴内悬浮的菌体量无关。
[0012]Rapid simultaneous testing of multiple antibio本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种直接靶板微滴生长装置，其特征在于，包括：底座，包括靶板托槽和环形水槽，所述环形水槽围绕所述靶板托槽；靶板，位于所述靶板托槽内，且所述靶板的一侧面设置有多个疏水环；密封垫，与所述底座和所述靶板的一侧面贴合，所述密封垫包括与所述环形水槽对应的多个第一水槽孔和与多个所述疏水环对应的多个第一疏水孔；孔槽板，位于所述密封垫之上，包括与多个所述第一水槽孔对应的多个第二水槽孔和与多个所述第一疏水孔对应的多个第二疏水孔，使所述环形水槽、多个所述第一水槽孔和多个所述第二水槽孔组成水槽孔，使多个所述疏水环、多个所述第一疏水孔和多个所述第二疏水孔组成加样孔；顶盖，位于所述孔槽板之上，与所述底座卡合，且与所述孔槽板的顶部和所述底座的四周具有缝隙，便于空气疏通。2.根据权利要求1所述的直接靶板微滴生长装置，其特征在于，所述底座还包括：底座板，所述环形水槽和所述靶板托槽位于所述底座板上，且两者并不连通；多个弹性按键，位于所述靶板托槽的凸边上；多个固定柱，其一端分别固定在所述底座板的四角位置上。3.根据权利要求1所述的直接靶板微滴生长装置，其特征在于，所述靶板包括靶板本体，多个所述疏水环覆在所述靶板本体的一侧表面，且所述靶板本体的数量与所述靶板托槽的数量相同。4.根据权利要求2所述的直接靶板微滴生长装置，其特征在于，所述密封垫还包括：密封垫本体，多个所述第一水槽孔和多个所述第一疏水孔穿透所述密封垫本体，且所述密封垫本体的一侧面与所述底座和设置有多个所述疏水环的靶板表面贴合；多个第一密封孔，分别位于所述密封垫本体的四角位置上。5.根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐伟，刘颖，周强，许安，李昕，姚杰，刘周，
申请(专利权)人：中国科学院合肥物质科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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