本发明专利技术公开了一种诱导细胞集落生长的半固体培养基，由IMDM培养基、甲基纤维素、胎牛血清、诱导因子和添加物组成；甲基纤维素以甲基纤维素母液的形式加入，通过以下方法制备得到：(1)取纯水，80～98℃水浴加热，加入甲基纤维素粉末，搅拌使甲基纤维素粉末分散湿润；(2)继续水浴加热10～20min；(3)高压灭菌；(4)降温至室温，静置16～24小时；(5)置于4℃下静置16～24小时，颠倒混匀，得甲基纤维素母液。本发明专利技术的诱导细胞集落生长的半固体培养基，采用特定的方法配制甲基纤维素母液，使得甲基纤维素溶解更充分，更有利于集落生成，可用于培养、检测造血干细胞，用于诱导单核细胞、粒细胞、红系细胞集落生长。胞集落生长。胞集落生长。
【技术实现步骤摘要】
诱导集落生长的半固体培养基及其制备方法与应用
[0001]本专利技术涉及一种诱导集落生长的半固体培养基及其制备方法与应用，属于细胞培养
技术介绍
[0002]脐血造血干细胞(Hematopoietic Stem Cell，HSC)有定向分化为红细胞、粒细胞、单核－巨噬细胞和巨核细胞等髓系细胞的祖细胞的能力。体外半固体细胞培养集落形成单位是评价造血前体细胞增殖分化能力的重要指标，在适宜的细胞因子诱导下，不同的定向祖细胞可产生相应的集落，如CFU
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GM、BFU
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E、CFU
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GEMM等。
[0003]现有技术中临床评价脐血质量的指标主要有HLA匹配程度、有核细胞总数、CD34+细胞数量以及CFU
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GM集落数量，这些指标是决定脐血移植后受者造血和免疫重建成功与否的重要因素。CFU
‑
GM集落数量能够较好反映脐血造血干细胞的增殖分化能力，与造血重建的快慢和植入率有关。HSC在体外培养产生集落(CFUs)的数量可以定量多潜能的祖细胞数量，反映HSC活性。
[0004]目前，国内脐血库使用的集落培养试剂为进口品牌，国内暂无国产品牌集落培养基产品上市。因此，有必要开展成品集落培养基配制工艺研究，突破技术壁垒，打破国外产品对中国市场的垄断，降低检测成本。
技术实现思路
[0005]针对上述现有技术，本专利技术提供了一种诱导细胞集落生长的半固体培养基及其制备方法与应用。
[0006]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0007]一种诱导细胞集落生长的半固体培养基，是由IMDM培养基、甲基纤维素、胎牛血清、诱导因子和添加物组成的；其中，甲基纤维素的浓度为1.3％～1.5％(w/v，g/ml)，胎牛血清的浓度为20％～40％(体积百分比)，优选30％；
[0008]所述诱导因子的具体种类和终浓度如下：SCF，20～50ng/ml；GM
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CSF，10～20ng/ml；IL
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3，10～20ng/ml；G
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CSF，10～50ng/ml；IL
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6，10～50ng/ml；Flt
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3L 100～200ng/mL；Valproic Acid(丙戊酸)1mM；TPO 50～100ng/ml；肝素钠，8～12U/ml；
[0009]所述添加物的具体种类和终浓度如下：GultaMAX添加剂，0.9％～1.1％(v/v)；β
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巯基乙醇，0.25～0.35mol/l；青霉素90～110U/mL；链霉素90～110U/mL。
[0010]制备半固体培养基时，甲基纤维素是以甲基纤维素母液的形式加入的，甲基纤维素母液是通过以下方法制备得到的：
[0011](1)取适量纯水，80～98℃水浴加热至水温平衡，加入甲基纤维素粉末，充分搅拌使甲基纤维素粉末完全分散湿润；
[0012]所述甲基纤维素粉末的粘度为3500～5600cPs，优选4000cPs；
[0013](2)继续80～98℃水浴加热10～20min；
[0014](3)水浴加热完成后，立即进行高压灭菌，高压灭菌的参数为：温度121℃，时间16～35min，优选33min；
[0015](4)高压灭菌后，自然降温至室温，静置16～24小时；
[0016](5)置于4℃环境下静置16～24小时，此时的甲基纤维素母液分层，上层溶度低粘度小，下层粘度大，颠倒混匀，即得甲基纤维素母液，甲基纤维素母液的浓度为2.5％～3.0％(w/v，g/ml)。
[0017]所述诱导细胞集落生长的半固体培养基的制备方法，包括以下步骤：
[0018](一)甲基纤维素母液的配制
[0019](1)取适量纯水，80～98℃水浴加热至水温平衡，加入甲基纤维素粉末，充分搅拌使甲基纤维素粉末完全分散湿润；
[0020]所述甲基纤维素粉末的粘度为3500～5600cPs，优选4000cPs；
[0021](2)继续80～98℃水浴加热10～20min；
[0022](3)水浴加热完成后，立即进行高压灭菌，高压灭菌的参数为：温度121℃，时间16～35min，优选33min；
[0023](4)高压灭菌后，自然降温至室温，静置16～24小时；
[0024](5)置于4℃环境下静置16～24小时，此时的甲基纤维素母液分层，上层溶度低粘度小，下层粘度大，颠倒混匀，即得甲基纤维素母液，甲基纤维素母液的浓度为2.5％～3.0％(w/v，g/ml)；
[0025](二)半固体培养基的配制：将甲基纤维素母液、IMDM培养基母液和胎牛血清混合，加入各诱导因子和添加物(不分次序)，混匀，即得。
[0026]所述IMDM培养基母液是由IMDM粉末经超纯水配制的，IMDM培养基母液的浓度满足以下条件：在半固体培养基中，IMDM培养基的浓度为1
×
(IMDM培养基为现有技术中已有的商品化产品，其组成固定)。
[0027]所述诱导细胞集落生长的半固体培养基，在培养细胞中的应用，在诱导单核细胞、粒细胞、红系细胞集落生长中的应用。
[0028]本专利技术的诱导细胞集落生长的半固体培养基，采用特定的方法配制甲基纤维素母液，可以使得甲基纤维素溶解更充分，更有利于集落生成。在配制甲基纤维素母液时，甲基纤维素粉末充分分散并且湿润后，水浴蒸煮，然后立即转移进行高温灭菌，保证甲基纤维素粉末在液体中为不溶解状态(分散状态)；高压灭菌后室温静置加低温静置，使甲基纤维素充分吸水膨胀(甲基纤维素随着温度的降低逐渐吸水溶解，不易产生团块)，这样配制的甲基纤维素溶液状态均一，无粘度较大的团块。
[0029]本专利技术的诱导细胞集落生长的半固体培养基，可用于培养、检测造血干细胞，能客观反应造血干细胞的造血能力，同时大大降低检测成本。
[0030]本专利技术所涉及的IMDM培养基、各诱导因子和添加物，均为现有技术中已有的商品化产品，可市场购买得到。IMDM培养基、IMDM培养基母液可自行配制。
附图说明
[0031]图1：实施例与对比例1、对比例2配制的集落培养基进行造血干细胞集落培养时在显微镜下的照片，其中，A：实施例(40
×
)；B：对比例1(40
×
)；C：对比例2(40
×
)；D：对比例2
(100
×
)。
[0032]图2：实施例与对比例1、对比例2、对比例3配制的集落培养基进行造血干细胞集落培养后，造血干细胞培养集落生成数量比较示意图。
具体实施方式
[0033]下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明。然而，本专利技术的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本专利技术的精神和范围的前提下，可以对本专利技术进行各种变化和修饰。
[0034]下述实施例中本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种诱导细胞集落生长的半固体培养基，其特征在于：是由IMDM培养基、甲基纤维素、胎牛血清、诱导因子和添加物组成的；其中，甲基纤维素的浓度为1.3％～1.5％，胎牛血清的浓度为20％～40％；所述诱导因子的具体种类和终浓度如下：SCF，20～50ng/ml；GM
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CSF，10～20ng/ml；IL
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3，10～20ng/ml；G
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CSF，10～50ng/ml；IL
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6，10～50ng/ml；Flt
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3L 100～200ng/mL；Valproic Acid 1mM；TPO 50～100ng/ml；肝素钠，8～12U/ml；所述添加物的具体种类和终浓度如下：GultaMAX添加剂，0.9％～1.1％；β
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巯基乙醇，0.25～0.35mol/l；青霉素90～110U/mL；链霉素90～110U/mL；所述甲基纤维素是以甲基纤维素母液的形式加入的，甲基纤维素母液是通过以下方法制备得到的：(1)取适量纯水，80～98℃水浴加热至水温平衡，加入甲基纤维素粉末，充分搅拌使甲基纤维素粉末完全分散湿润；所述甲基纤维素粉末的粘度为3500～5600cPs；(2)继续80～98℃水浴加热10～20min；(3)水浴加热完成后，立即进行高压灭菌；(4)高压灭菌后，自然降温至室温，静置16～24小时；(5)置于4℃环境下静置16～24小时，颠倒混匀，即得甲基纤维素母液，甲基纤维素母液的浓度为2.5％～3.0％。2.根据权利要求1所述的诱导细胞集落生长的半固体培养基，其特征在于：所述甲基纤维素的浓度为1.5％，胎牛血清的浓度为30％。3.根据权利要求1所述的诱导细胞集落生长的半固体培养基，其特征在于，所述诱导因子的具体种类和终浓度如下：SCF，50ng/ml；GM
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CSF，20ng/ml；IL
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3，20ng/ml；G
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CSF，20ng...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘东，张剑慧，盛凯，李家梁，董雪，任曼莉，崔光晶，王肇光，魏本杰，
申请(专利权)人：银丰生物工程集团有限公司，
类型：发明
国别省市：
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