一种表征木质素与纤维素酶相互作用力的方法技术

本发明专利技术公开了一种表征木质素与纤维素酶相互作用力的方法，属于微观科学领域。本发明专利技术表征木质素与纤维素酶相互作用力的方法，包括以下步骤：(1)木质素膜的制备：配置木质素溶液，随后将溶液滴加于硅片上，用旋涂仪重复旋涂，所制得木质素膜真空干燥；(2)AFM探针修饰：将表面镀有金膜的AFM探针用HS

【技术实现步骤摘要】
一种表征木质素与纤维素酶相互作用力的方法


[0001]本专利技术属于微观科学领域，更具体地说，涉及一种表征木质素与纤维素酶相互作用力的方法。

技术介绍

[0002]利用可再生木质纤维素生物转化生产生物乙醇和液体燃料是解决化石资源短缺和能源安全的有效途径之一。在众多的生物炼制途径中，通过纤维素酶将木质纤维素水解成可发酵单糖是木质纤维生物转化过程中的关键一步。其中，酶与纤维素的直接接触是酶水解的必要前提。然而木质素与纤维素酶的非生产性结合，认为是阻碍纤维素可及性的顽固因素之一，其降低了糖化率和碳水化合物的得率，从而导致碳水化合物的糖化成本增加。尽管木质素对酶解的抑制作用非常重要，但其确切的抑制机理至今仍有争议，需要进一步阐明。
[0003]目前，研究预处理过程中表面木质素和残留木质素与纤维素酶的相互作用机制，是木质纤维生物炼制重要的关注点。通常认为，木质素的疏水性、带电性和官能团等理化特性使木质素分子与纤维素酶分子以一定的作用力相互吸附，被吸附的纤维素酶与木质素“牢固”结合，减少了水解体系中游离纤维素酶，从而降低纤维素糖化效率。由于木质纤维原料与纤维素酶相互作用的复杂性，目前酶解过程中葡萄糖得率仍然是衡量木质纤维原料酶解效率的重要指标。但这种衡量方法具有较大的局限性，只能单一的研究纤维素酶水解底物的效率，无法得到微观角度整个吸附与解吸动态过程与结合力，从而解析木质素和纤维素酶的相互作用机制。
[0004]随着先进分析技术的快速发展，木质素/表面活性剂
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纤维素酶的相互作用机制有了显著的进展。原子力显微镜(AFM)以高空间分辨率、力敏感的特性使其可以在纳米尺度下对蛋白进行成像，并且在皮牛的范围内研究生物分子间的相互作用，目前被广泛应用于定量测量蛋白质与生物大分子间的相互作用力。木质素与酶相互作用时，分离它们所需的力通常被称为为“粘附力”。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种表征木质素与纤维素酶相互作用力的方法。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0007]一种表征木质素与纤维素酶相互作用力的方法，包括以下步骤：
[0008](1)木质素膜的制备：配置木质素溶液或木质素模型物溶液，随后将溶液滴加于硅片上，用旋涂仪重复旋涂，所制得木质素膜真空干燥；
[0009](2)AFM探针修饰：将表面镀有金膜的AFM探针用HS
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PEG
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COOH修饰后进行羧基活化，将羧基活化后的AFM探针浸入纤维素酶的PBS溶液中孵育，修饰结束后，洗涤后的AFM探针放置在PBS缓冲溶液中保存待用；
[0010](3)液相环境下采用AFM仪器测试木质素
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纤维素酶作用力。
[0011]进一步地，所述的木质素膜的制备具体方法为：
[0012]配置0.5％(w/v，DMSO)的木质素溶液或木质素模型物溶液，随后用平口注射器滴加100μL溶液于硅片上，待溶液扩散至整个硅片表面后静置1min，用旋涂仪以5kr/min的速度旋涂1min，重复3次；所制得木质素膜在40℃下真空干燥4h，然后在去离子水中浸泡1天；间隔2h更换去离子水，确保DMSO完全去除，避免影响纤维素酶活性；浸泡后的膜在40℃下真空干燥12h。
[0013]进一步地，所述的AFM探针修饰的具体方法为：
[0014]将表面镀有金膜的AFM探针浸入0.2mg/mL的HS
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PEG
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COOH的DMSO溶液中室温避光孵育3h；将修饰了PEG的探针用DMSO洗涤三次后，放置在小于50℃的温水中，静置30min以除去探针表面物理吸附的PEG分子；然后将AFM探针浸入10mM的NHS/EDC混合PBS缓冲液中，室温孵育30min；将羧基活化的AFM探针浸入纤维素酶的PBS溶液中，4℃下避光孵育过夜；修饰结束后，用PBS溶液洗涤AFM探针三次，重新放置在PBS缓冲溶液中保存待用。
[0015]进一步地，所述的纤维素酶PBS溶液摩尔质量为0.2μM，pH＝7.4。
[0016]进一步地，木质素与纤维素酶的结合能力通过相互作用反应的解离速率常数进行评估，在每个力加载速度下统计若干条有代表性的力
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位移曲线后，运用如下Bell
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Evans方程计算木质素与纤维素酶的解离力：
[0017][0018]其中F代表解离力，X
β
是在解离路径上结合状态能量最低处到分子活化状态的距离，R是解离力加载速率，R＝k
off
×
v是AFM探针悬梁臂的有效弹性系数，v是探针的回缩速率，k
off
是在力为零时的解离速率常数，T为热力学温度，k
B
是玻尔兹曼常数。
[0019]进一步地，所述的木质素模型物为以下物质中的一种或几种：
[0020][0021]相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：
[0022]AFM探针可以被修饰以具有特定的化学甚至生化特性，使得AFM以原子分辨率在纳米级，表征特定蛋白质分子和配体之间的相互作用力。也可用于表征从亚分子水平到细胞水平的各个领域的表面形态，该结果可以观察单个分子在生理环境中所经历的动态变化，
并可以在分子水平上操纵聚合物，因此本专利技术利用AFM评估酶(蛋白质)和木质素(生物大分子)之间的相互作用力和解离速率，定量表征二者在液体环境下的相互作用。目前，该方法是唯一能在液相环境中表征木质素与纤维素酶的纳米级作用力。相关表征结果表明：
[0023]1)与预处理物料表面木质素相比，残留木质素与纤维素酶存在更强的相互作用力，导致酶水解过程中游离纤维素酶含量降低，从而导致底物酶水解得率更低。
[0024]2)随着预处理温度的升高，物料表面木质素/残留木质素与纤维素酶的作用力降低，解离速率增加。
[0025]3)三种常见的木质素单体与纤维素酶的作用力大小依次为H＞S＞G，这与其抑制酶水解的效果一致。
[0026]4)二聚体与纤维素酶的相互作用力强于单体模型物的。另外，空间位阻、甲氧基和脂肪族羟基仍然是导致木质素与酶非生产性结合的重要因素。
[0027]5)相较于物料中的木质素，木质素模型物与纤维素酶的解离速率更小，表明木质素模型物与纤维素酶结合后更不容易发生解离。
[0028]可见，AFM在表征木质素与纤维素酶相互作用力中具有更加广泛的应用。
附图说明
[0029]图1为不同温度水热预处理杨木表面木质素、残留木质素的形貌图；不同温度水热预处理杨木表面木质素、残留木质素与纤维素酶的作用力
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位移曲线以及作用力分布直方图；(a：表面木质素；b：残留木质素)；
[0030]图2为170℃水热预处理条件下表面木质素与纤维素酶在不同加载力速度下的作用力统计直方图以及解离速率拟合图；
[0031]图3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表征木质素与纤维素酶相互作用力的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)木质素膜的制备：配置木质素溶液或木质素模型物溶液，随后将溶液滴加于硅片上，用旋涂仪重复旋涂，所制得木质素膜真空干燥；(2)AFM探针修饰：将表面镀有金膜的AFM探针用HS
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PEG
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COOH修饰后进行羧基活化，将羧基活化后的AFM探针浸入纤维素酶的PBS溶液中孵育，修饰结束后，洗涤后的AFM探针放置在PBS缓冲溶液中保存待用；(3)液相环境下采用AFM仪器测试木质素
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纤维素酶作用力。2.根据权利要求1所述的表征木质素与纤维素酶相互作用力的方法，其特征在于，所述的木质素膜的制备具体方法为：配置0.5％的木质素溶液或木质素模型物溶液，随后用平口注射器滴加100μL溶液于硅片上，待溶液扩散至整个硅片表面后静置1min，用旋涂仪以5kr/min的速度旋涂1min，重复3次；所制得木质素膜在40℃下真空干燥4h，然后在去离子水中浸泡1天；间隔2h更换去离子水，去除DMSO；浸泡后的膜在40℃下真空干燥12h。3.根据权利要求1所述的表征木质素与纤维素酶相互作用力的方法，其特征在于，所述的AFM探针修饰的具体方法为：将表面镀有金膜的AFM探针浸入0.2mg/mL的HS
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PEG
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COOH的DMSO溶液中室温避光孵育3h；将修饰了PEG的探针用DMS...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄曹兴，赵晓雪，勇强，赖晨欢，金永灿，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：