一种利用微生物将铁冬青酸转化为其衍生物的方法及其在制备降脂药物中的应用技术

本发明专利技术公开了一种利用微生物将铁冬青酸转化为其衍生物的方法及其在制备降脂药物中的应用。本发明专利技术所述利用微生物将铁冬青酸转化为其衍生物的方法中所用微生物为救必应内生真菌Lasiodiplodia sp.JBY

【技术实现步骤摘要】
一种利用微生物将铁冬青酸转化为其衍生物的方法及其在制备降脂药物中的应用


[0001]本专利技术属于微生物
更具体地，涉及一种利用微生物将铁冬青酸转化为其衍生物的方法及其在制备降脂药物中的应用。

技术介绍

[0002]铁冬青酸(Rotundic acid)是一种从冬青属铁冬青(Ilex rotunda Thunb.)中分离得到的乌苏烷型三萜皂苷，其具有较好的抗肿瘤、降血脂、抗血栓和抗炎活性，但是较差的溶解性和生物利用度在一定程度上限制了其临床应用。因此，有必要对其进行适当的结构修饰，以期改善其溶解性和生物利用度，扩大其临床应用。
[0003]目前，对铁冬青酸进行结构修饰的方法包括化学方法和微生物转化修饰两种。采用化学方法制备所得铁冬青酸类衍生物的溶解性、生物利用度和抗肿瘤活性虽较铁冬青酸有显著的提高(赫玉芳.救必应酸的制备及其衍生物的设计、合成和抗肿瘤活性研究[D].吉林大学,2013)，但化学方法制备铁冬青酸类衍生物的反应过程复杂、条件要求高、所用试剂毒性大、副产物较多、产率较低，在实际应用中有很大的局限性。
[0004]微生物转化是指利用微生物代谢过程中所产生的一系列酶对外源性的底物进行选择性结构修饰的过程，具有较好的立体性和区域选择性，能够对非活性碳原子进行结构修饰，或能较大程度地改善底物溶解性、生物利用度和活性等。同时，微生物转化的反应条件温和、成本低，产物的分离纯化相对简单，这些优点均是化学方法所不具备的。目前已有关于对真菌转化培养获得的代谢产物活性的研究，不仅可用于揭示药物进入体内发挥作用的物质基础，亦有助于发现更好药理活性及生物利用度的衍生物。因此，挖掘开发可对铁冬青酸进行结构修饰以提高其活性的微生物，对提高铁冬青酸药理活性，扩大铁冬青酸的临床应用范围具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种利用微生物将铁冬青酸转化为其衍生物的方法及其在制备降脂药物中的应用。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一株救必应内生真菌Lasiodiplodia sp.JBY
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33。
[0007]本专利技术的第二个目的是提供一种铁冬青酸衍生物M。
[0008]本专利技术的第三个目的是提供一种制备铁冬青酸衍生物M的方法。
[0009]本专利技术的第四个目的是提供所述救必应内生真菌Lasiodiplodia sp.JBY
‑
33在制备铁冬青酸衍生物M中的应用。
[0010]本专利技术的第五个目的是提供所述铁冬青酸衍生物M在制备降脂药物中的应用。
[0011]本专利技术的第六个目的是提供一种降脂药物。
[0012]本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：
[0013]本专利技术利用组织块分离法，从中药救必应的新鲜树皮中分离得到了一株内生真
菌，通过扩增其ITS区域后测序比对发现所得内生真菌为Lasiodiplodia sp.真菌，将其命名为Lasiodiplodia sp.JBY
‑
33菌株。本专利技术通过在培养液中添加铁冬青酸溶液发现，所述Lasiodiplodia sp.JBY
‑
33菌株可以将铁冬青酸转化为铁冬青酸衍生物M(19a,22a,24
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trihydroxy
‑
urs
‑3‑
oxo
‑
12
‑
ene
‑
28
‑
oic acid)，其结构式如式(I)所示，为新化合物，量大纯度高，且在降脂活性筛选中显示具有比原药铁冬青酸更好的降脂活性。因此，本专利技术申请保护Lasiodiplodia sp.JBY
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33菌株及其铁冬青酸衍生物的制备方法和应用。
[0014]本专利技术请求保护所述救必应内生真菌Lasiodiplodia sp.JBY
‑
33，该菌株于2022年09月02日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：62757。
[0015]本专利技术还请求保护一种铁冬青酸衍生物M(亦可简称为“衍生物M”)，所述衍生物M的结构式如式(I)所示：
[0016][0017]本专利技术还提供了一种利用微生物将铁冬青酸转化为其衍生物的方法，即制备式(I)所述铁冬青酸衍生物M的方法，所述衍生物M是将内生真菌Lasiodiplodia sp.JBY
‑
33置于含铁冬青酸的培养基中培养分离得到。
[0018]具体地，所述制备铁冬青酸衍生物M的方法包括以下步骤：
[0019]S1.真菌Lasiodiplodia sp.JBY
‑
33的活化；
[0020]S2.制备Lasiodiplodia sp.JBY
‑
33种子培养液；
[0021]S3.将步骤S2所得种子培养液接种至液体培养基中，25～35℃条件下振荡培养12～48h后加入铁冬青酸溶液，相同条件下转化培养24～168h后抽滤；
[0022]S4.将步骤S3抽滤所得滤渣用1～3倍质量的甲醇进行提取，合并滤液和甲醇提取液，减压回收得到转化浸膏；
[0023]S5.用1～3倍体积的乙酸乙酯对步骤S4所得转化浸膏进行萃取，萃取物经反相柱色谱分离，依次用4～7倍柱体积的40％、50％、60％、70％的甲醇/水梯度洗脱，收集并回收70％甲醇/水洗脱部分，甲醇重结晶即得铁冬青酸衍生物M。
[0024]具体地，在重结晶后，采用HR
‑
ESI
‑
TOF
‑
MS和NMR法鉴定转化产物的结构。
[0025]具体地，步骤S1所述活化为将冷冻保藏的Lasiodiplodia sp.JBY
‑
33接种于斜面培养基上，25～35℃条件下静置培养24～96h。
[0026]更具体地，将冷冻保藏的Lasiodiplodia sp.JBY
‑
33接种于斜面培养基上，28℃条件下静置培养48h。
[0027]具体地，步骤S2所述种子培养液是将活化后的Lasiodiplodia sp.JBY
‑
33的孢子接种至液体培养基中，于25～35℃、100～200rpm/min条件下恒温振荡培养24～48h得到。
[0028]更具体地，所述种子培养液是将活化后的Lasiodiplodia sp.JBY
‑
33的孢子接种至液体培养基中，于28℃、160rpm/min条件下恒温振荡培养24h得到。
[0029]具体地，步骤S3中种子液的接种量为1～15％，加入的铁冬青酸溶液的终浓度为0.05～0.50g/L。
[0030]更具体地，步骤S3中种子液的接种量为5％，28℃、160rpm/min条件下恒温振荡培养24h后，加入终浓度为0.2g/L的铁冬青酸溶液，相同条件下转化培养144h后抽滤。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株救必应内生真菌Lasiodiplodia sp.JBY
‑
33，其特征在于，所述内生真菌于2022年09月02日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：62757。2.一种铁冬青酸衍生物M，其特征在于，所述衍生物M的结构式如式(I)所示：3.一种制备权利要求2所述铁冬青酸衍生物M的方法，其特征在于，所述衍生物M是将权利要求1所述内生真菌置于含铁冬青酸的培养基中培养后分离得到。4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.真菌Lasiodiplodia sp.JBY
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33的活化；S2.制备Lasiodiplodia sp.JBY
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33种子培养液；S3.将步骤S2所得种子培养液接种至液体培养基中，25～35℃条件下振荡培养12～48h后加入铁冬青酸溶液，相同条件下转化培养24～168h后抽滤；S4.将步骤S3抽滤所得滤渣用1～3倍质量的甲醇进行提取，合并滤液和甲醇提取液，减压回收得到转化浸膏；S5.用1～3倍体积的乙酸乙酯对步骤S4所得转化浸膏进行萃取，萃取物经反相柱色谱分离，依...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵钟祥，卢淇平，崔辉，幸丹霞，
申请(专利权)人：广州中医药大学广州中医药研究院，
类型：发明
国别省市：