用于修饰靶核酸的组合物和方法技术

本公开提供了使用供体构建体修饰靶核酸的组合物和方法，所述供体构建体包括含有单链同源定向修复模板(ssHDRT)以及一条或多条DNA结合蛋白靶序列的至少一个供体模板，其中至少一条DNA结合蛋白靶序列与互补的多核苷酸序列形成双链双链体。形成双链双链体。形成双链双链体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于修饰靶核酸的组合物和方法
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2020年3月13日递交的美国临时申请第62/989,501号的优先权，其公开内容在此通过引用整体并入本文中，以用于所有目的。关于在联邦政府赞助的研究和开发下进行的专利技术权利的声明
[0002]本专利技术是根据国立卫生研究院(The National Institutes of Health)授予的第P50 GM082250号基金在政府支持下进行的。政府享有本专利技术的某些权利。本公开的背景
[0003]成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关(Cas)蛋白的应用通过使基因组编辑成为可能，从而彻底改变了分子生物学。CRISPR介导的基因编辑是一种强大而实用的工具，其具有创造新的科学工具、纠正临床相关突变并使新的基于细胞的免疫疗法工程化的潜力。本公开的概述
[0004]在一方面，本公开的特征在于供体构建体，其包含含有单链同源定向修复模板(HDRT)以及一条或多条DNA结合蛋白靶序列的至少一个供体模板，其中至少一条DNA结合蛋白靶序列与互补多核苷酸序列形成双链双链体。
[0005]在一些实施方案中，所述供体构建体包含(a)含有单一供体模板的第一多核苷酸，和(b)含有互补的多核苷酸序列的至少一个第二多核苷酸，其中所述供体模板是单链线性模板。在一些实施方案中，所述供体模板仅包含一条DNA结合蛋白靶序列，并且其中所述DNA结合蛋白靶序列与所述互补的多核苷酸序列杂交。在某些实施方案中，所述DNA结合蛋白靶序列位于所述供体模板的5
’
端处或所述供体模板5
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端的近端。在其他实施方案中，所述DNA结合蛋白靶序列位于所述供体模板的3
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端处或所述供体模板3
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端的近端。
[0006]在本方面的一些实施方案中，所述供体模板包含：位于所述供体模板的5
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端处或所述供体模板5
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端近端的第一DNA结合蛋白靶序列；位于所述供体模板的3
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端处或所述供体模板3
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端近端的第二DNA结合蛋白靶序列；第一互补的多核苷酸序列；和第二互补的多核苷酸序列，其中所述第一DNA结合蛋白靶序列与所述第一互补的多核苷酸序列杂交，并且所述第二DNA结合蛋白靶序列与所述第二互补的多核苷酸序列杂交。
[0007]在本方面的一些实施方案中，所述供体构建体包含(a)第一供体模板，其含有位于所述第一供体模板的3
’
端处或所述第一供体模板3
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端近端的第一DNA结合蛋白靶序列，和(b)第二供体模板，其含有位于所述第二供体模板的3
’
端处或所述第二供体模板3
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端近端的第二DNA结合蛋白靶序列，其中所述第一DNA结合蛋白靶序列与所述第二DNA结合蛋白靶序列杂交。在一些实施方案中，所述第二供体模板还包含位于所述第二供体模板的5
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端处或所述第二供体模板5
’
端近端的第三DNA结合蛋白靶序列，并且所述供体构建体还包含(c)第三供体模板，其含有位于所述第三模板的5
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端处或所述第三模板5
’
端近端的第四DNA结合蛋白靶序列，其中所述第三DNA结合蛋白靶序列与所述第四DNA结合蛋白靶序列杂交。
[0008]在本方面的一些实施方案中，所述DNA结合蛋白靶序列和所述互补的多核苷酸序列形成发夹。在某些实施方案中，所述供体构建体包含单一供体模板，并且所述供体模板包
含由第一DNA结合蛋白靶序列和作为互补的多核苷酸序列的第二DNA结合蛋白靶序列形成的单一发夹。在一些实施方案中，所述供体构建体包含单一供体模板，并且所述供体模板包含两个发夹以及：(a)第一DNA结合蛋白靶序列；(b)作为第一互补的多核苷酸序列的第二DNA结合蛋白靶序列；(c)第三DNA结合蛋白靶序列；和(d)作为第二互补的多核苷酸序列的第四DNA结合蛋白靶序列，其中所述第一DNA结合蛋白靶序列与所述第二DNA结合蛋白靶序列杂交以在所述供体模板的5
’
端处或所述供体模板5
’
端的近端形成第一发夹，并且所述第三DNA结合蛋白靶序列与所述第四DNA结合蛋白靶序列杂交以在所述供体模板的3
’
端处所述供体模板3
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端的近端形成第二发夹。
[0009]在某些实施方案中，所述供体模板还包含第三DNA结合蛋白靶序列，并且所述供体构建体还包含含有第二互补的多核苷酸序列的多核苷酸，其中所述第三DNA结合蛋白靶序列与所述第二互补的多核苷酸序列杂交。
[0010]在一些实施方案中，所述供体构建体包含第一供体模板和第二供体模板，所述第一供体模板和所述第二供体模板各自包含第一DNA结合蛋白靶序列和作为互补的多核苷酸序列的第二DNA结合蛋白靶序列，并且其中所述第一供体模板的一部分和所述第二供体模板的一部分彼此杂交。
[0011]在一些实施方案中，所述供体构建体包含单一供体模板，并且所述供体模板包含：(a)第一片段，其包含由第一DNA结合蛋白靶序列和作为互补的多核苷酸序列的第二DNA结合蛋白靶序列形成的第一发夹；(b)第二片段，其包含由第三DNA结合蛋白靶序列和作为互补的多核苷酸序列的第四DNA结合蛋白靶序列形成的第二发夹；和(c)第三片段，其包含HDRT，其中所述第一片段的一部分与所述第三片段的5
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部分杂交，并且所述第二片段的一部分与所述第三片段的3
’
部分杂交。
[0012]在本方面的一些实施方案中，所述DNA结合蛋白靶序列被供体向导RNA(gRNA)结合，所述供体向导RNA被RNA引导的核酸酶结合。在具体实施方案中，所述RNA引导的核酸酶是Cas蛋白。Cas蛋白的实例包括但不限于：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也被称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1和以上的变体。
[0013]在一些实施方案中，所述DNA结合蛋白靶序列包含SEQ ID NOS:30
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35中任一个的序列。在一些实施方案中，所述供体模板包含一个或多个原间隔序列邻近基序(PAM)。在具体实施方案中，所述PAM位于所述DNA结合蛋白靶序列的5
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端处。在具体实施方案中，所述PAM位于所述DNA结合蛋白靶序列的3
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端处。
[0014]在另一方面，本公开提供了用于修饰靶核酸的组合物，其包含：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.供体构建体，其包含含有单链同源定向修复模板(HDRT)以及一条或多条DNA结合蛋白靶序列的至少一个供体模板，其中至少一条DNA结合蛋白靶序列与互补的多核苷酸序列形成双链双链体。2.如权利要求1所述的供体构建体，其中所述供体构建体包含(a)含有单一供体模板的第一多核苷酸，和(b)含有互补的多核苷酸序列的至少一个第二多核苷酸，其中所述供体模板是单链线性模板。3.如权利要求2所述的供体构建体，其中所述供体模板仅包含一种DNA结合蛋白靶序列，并且其中所述DNA结合蛋白靶序列与所述互补的多核苷酸序列杂交。4.如权利要求3所述的供体构建体，其中所述DNA结合蛋白靶序列位于所述供体模板的5
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端处或所述供体模板5
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端的近端。5.如权利要求3所述的供体构建体，其中所述DNA结合蛋白靶序列位于所述供体模板的3
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端处或所述供体模板3
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端的近端。6.如权利要求2所述的供体构建体，其中所述供体模板包含：位于所述供体模板的5
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端处或所述供体模板5
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端近端的第一DNA结合蛋白靶序列；位于所述供体模板的3
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端处或所述供体模板3
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端近端的第二DNA结合蛋白靶序列；第一互补的多核苷酸序列；和第二互补的多核苷酸序列，其中所述第一DNA结合蛋白靶序列与所述第一互补的多核苷酸序列杂交，并且所述第二DNA结合蛋白靶序列与所述第二互补的多核苷酸序列杂交。7.如权利要求1所述的供体构建体，其中所述供体构建体包含(a)第一供体模板，其含有位于所述第一供体模板的3
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端处或所述第一供体模板3
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端近端的第一DNA结合蛋白靶序列，和(b)第二供体模板，其含有位于所述第二供体模板的3
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端处或所述第二供体模板3
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端近端的第二DNA结合蛋白靶序列，其中所述第一DNA结合蛋白靶序列与所述第二DNA结合蛋白靶序列杂交。8.如权利要求7所述的供体构建体，其中所述第二供体模板还包含位于所述第二供体模板的5
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端处或所述第二供体模板5
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端近端的第三DNA结合蛋白靶序列，并且所述供体构建体还包含(c)第三供体模板，其含有位于所述第三模板的5
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端处或所述第三模板5
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端近端的第四DNA结合蛋白靶序列，其中所述第三DNA结合蛋白靶序列与所述第四DNA结合蛋白靶序列杂交。9.如权利要求1所述的供体构建体，其中所述DNA结合蛋白靶序列和所述互补的多核苷酸序列形成发夹。10.如权利要求9所述的供体构建体，其中所述供体构建体包含单一供体模板，并且所述供体模板包含由第一DNA结合蛋白靶序列和作为互补的多核苷酸序列的第二DNA结合蛋白靶序列形成的单一发夹。11.如权利要求9所述的供体构建体，其中所述供体构建体包含单一供体模板，并且所述供体模板包含两个发夹以及：(a)第一DNA结合蛋白靶序列；(b)作为第一互补的多核苷酸序列的第二DNA结合蛋白靶序列；(c)第三DNA结合蛋白靶序列；和
(d)作为第二互补的多核苷酸序列的第四DNA结合蛋白靶序列，其中所述第一DNA结合蛋白靶序列与所述第二DNA结合蛋白靶序列杂交以在所述供体模板的5
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端处或所述供体模板5
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端的近端形成第一发夹，并且所述第三DNA结合蛋白靶序列与所述第四DNA结合蛋白靶序列杂交以在所述供体模板的3
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端处或所述供体模板3
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端的近端形成第二发夹。12.如权利要求10所述的供体构建体，其中所述供体模板还包含第三DNA结合蛋白靶序列，并且所述供体构建体还包含含有第二互补的多核苷酸序列的多核苷酸，其中所述第三DNA结合蛋白靶序列与所述第二互补的多核苷酸序列杂交。13.如权利要求9所述的供体构建体，其中所述供体构建体包含第一供体模板和第二供体模板，所述第一供体模板和所述第二供体模板各自包含第一DNA结合蛋白靶序列和作为互补的多核苷酸序列的第二DNA结合蛋白靶序列，并且其中所述第一供体模板的一部分和所述第二供体模板的一部分彼此杂交。14.如权利要求9所述的供体构建体，其中所述供体构建体包含单一供体模板，并且所述供体模板包含：(a)第一片段，其包含由第一DNA结合蛋白靶...

【专利技术属性】
技术研发人员：亚历山大，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：