用于热辅助酶消化的方法技术

本公开涉及一种消化包含蛋白质的样本的方法，该方法包括：将样本添加到装置中，该装置容纳缓冲液和包括表面涂层的固体载体表面，其中表面涂层使酶固定化，同时减少样本与固体载体表面之间的不期望的相互作用；使酶固定化在表面涂层上以用于消化样本的蛋白质；以及加热样本以完成蛋白质的热辅助消化。样本以完成蛋白质的热辅助消化。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于热辅助酶消化的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年5月8日提交的名称为“Methods for Heat
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Assisted Enzyme Digestion”的美国临时专利申请第63/022,056号的优先权和权益。该专利申请的内容全文以引用方式并入本文。


[0003]本公开涉及用于热辅助生物分子样本处理(例如，消化和亲和配体纯化)的方法。更具体地，本公开涉及涂层(诸如异官能涂层)结合用于进行生物分析的样本处理(例如，清理、样本释放)的热量将生物分子缀合在固体载体表面上的用途。

技术介绍

[0004]生物分子是复杂的分子，其需要复杂的工作流进行分析。这些复杂的工作流涉及多个步骤，包括各种样本制备步骤，诸如样本清理和蛋白质消化。在不影响样本质量(例如，不引入需要附加清理的副产品)的情况下，获得基本上完全消化具有挑战性。例如，一些用于消化的酶当在溶液中使用时可能变得不稳定，从而导致副产品。在升高的温度下进行消化可改善工作流的吞吐量。然而，由于因热诱导的变性或其它构象变化，酶通常在特定温度范围内最有效。但是在酶的特定温度范围内，蛋白质的自溶可显著增多。另外，热源的硬件可能难以对可再现性进行基准测试和评估。

技术实现思路

[0005]生物分子是复杂的分子，其需要复杂的工作流进行分析。这些复杂的工作流涉及多个步骤，包括各种样本制备步骤，诸如样本清理和蛋白质消化。在不影响样本质量(例如，不引入需要附加清理的副产品)的情况下，获得基本上完全消化具有挑战性。例如，一些用于消化的酶当在溶液中使用时可能变得不稳定，从而导致副产品。
[0006]然而，由于因热诱导的变性或其它构象变化，酶通常在特定温度范围内最有效。但是在酶的特定温度范围内，蛋白质的自溶可显著增多。另外，热源的硬件可能难以对可再现性进行基准测试和评估。
[0007]这些酶的固定化有助于使酶稳定。然而，用于使酶固定化的常规技术导致与载体的表面发生次级相互作用，从而影响消化效率和样本回收率。
[0008]利用固定化酶，可提高消化温度。并且可减少与升高的温度相关联的缺点。结果是在不牺牲消化质量的情况下增加了工作流。
[0009]一般来讲，本公开涉及一种快速消化方法，该快速消化方法由热辅助，以在数分钟内有效地完成消化，同时提供高保真肽谱，该快速消化方法是可靠的，并且适用于在受控环境中进行生物学研究或蛋白质治疗剂表征。高保真被定义为与常规溶液中消化工作流相比，提供治疗性蛋白质的＞95％序列覆盖率、＜10％漏切、可比改性(在25℃至100℃下进行消化之后，热诱导改性为大约＜5％，并且在一些示例中小于1％)的消化工作流结果。
[0010]高保真消化工作流用于肽图、二硫键图、中间向上、中间向下、自下而上的蛋白质组学、蛋白质鉴定、蛋白质定量、生物分析、其他消化相关应用或其他应用(例如，使用亲和配体的应用)。该方法包括热稳定酶、消化缓冲液(或其它类型的缓冲液)、热源以及通过清理或反应淬灭获得样本以备进行下游分析(荧光、UV、LC
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MS检测)的步骤。
[0011]本公开提供用于在热辅助的情况下进行快速酶消化的方法。快速消化方法可用于蛋白质/肽分析。一般来讲，该方法包括以下中的一者或多者：热稳定酶、消化缓冲液、热源以及通过清理或反应淬灭设定样本以备进行下游分析(荧光、UV、LC
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MS检测)的步骤。例如，一些方法包括以下组分：在固体载体上的具有优异的热稳定性和亲水性特性(使非特异性结合最小化)的固定化酶；在升高的温度下支持酶(诸如胰蛋白酶)活性的动力学，同时还使肽上的热诱导改性最小化的消化缓冲液；确保最大热传递效率，并且尽可能减少非特异性结合的装置(例如，小瓶、板或柱)。
[0012]本公开提供了一种处理包含蛋白质的样本的方法，该方法包括：将样本添加到装置中，该装置容纳缓冲液和包括表面涂层的固体载体表面，其中表面涂层使酶和亲和配体固定化，同时减少样本与固体载体表面之间的不期望的相互作用；使酶固定化在表面涂层上以用于消化样本中的蛋白质；将亲和配体固定化在表面涂层上以用于靶向捕获样本中的蛋白质；用表面涂层上的固定化酶消化样本中的蛋白质；用表面涂层上的固定化亲和配体靶向捕获样本的一部分；以及加热样本以激活蛋白质的消化。在一些实施方案中，靶向捕获样本的一部分的步骤发生在蛋白质的消化之前。在某些实施方案中，靶向捕获样本的一部分的步骤发生在消化期间。在一些实施方案中，靶向捕获样本的一部分的步骤发生在消化之后。并且在一些实施方案中，靶向捕获样本的一部分的步骤发生在蛋白质的消化之前、期间和/或之后。在一些实施方案中，缓冲液选自由以下项组成的组：Tris、BIS
‑
Tris、2
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乙磺酸(MES)、HEPES、三乙醇胺和三甲胺。缓冲液可含有二价离子，诸如CaCl2。溶液中的缓冲液可含有多元醇，该多元醇选自由以下项组成的组但不限于以下项：甘油、木糖醇、丙二醇、丁二醇或赤藓糖醇。在一些实施方案中，溶液中的缓冲液包含木糖醇和CaCl2。在一些实施方案中，将甲硫氨酸添加到溶液中的缓冲液中。在一些实施方案中，溶液中的缓冲液进一步包含一种或多种添加剂，诸如例如木糖醇、甲硫氨酸和/或CaCl2。
附图说明
[0013]通过以下结合附图所作的详细描述，将更充分地理解本技术，在附图中：
[0014]图1是根据本公开的热谱曲线图。
[0015]图2是根据本公开的热谱曲线图。
[0016]图3A是示出将精氨酸添加到消化缓冲液中对疏水性肽回收率的影响的图。图3B是示出将精氨酸添加到消化缓冲液中对消化效率的影响的图。图3C是示出将二甲基
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精氨酸添加到消化缓冲液中对疏水性肽回收率的影响的图。图3D是示出将二甲基
‑
精氨酸添加到消化缓冲液中对消化效率的影响的图。
[0017]图4是根据本公开的在用固定化酶培养之后的疏水性肽的混合物的回收率的图。
[0018]图5是在70℃下在消化缓冲液中培养之后的释放的胰蛋白酶的图。
[0019]图6A、图6B和图6C是显示NIST mAb在变化的条件下被消化之后生成的LC
‑
MS色谱的图。
[0020]图7是显示根据本公开的比较示例的漏切％和序列覆盖率％的图。
[0021]图8A、图8B和图8C是在不同温度下比较消化示例的图。
[0022]图9A和图9B是比较Ca
2+
浓度对消化效率和非特异性结合的影响的图。
[0023]图10A和图10B是比较pH对消化效率和脱酰胺％的影响的图。
[0024]图11A和图11B是比较Tris浓度对消化效率和非特异性结合的影响的图。
[0025]图12A和图12B是比较多元醇对消化效率和非特异性结合的影响的图。图12C是显示使用甘油和木糖醇的消化结果的比较的图。
[0026]图13是显示甲硫氨酸对防本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种消化包含蛋白质的样本的方法，所述方法包括：将所述样本添加到装置中，所述装置容纳缓冲液和包括表面涂层的固体载体表面，其中所述表面涂层使酶固定化，同时减少所述样本与所述固体载体表面之间的不期望的相互作用；使酶固定化在所述表面涂层上以用于消化所述样本的所述蛋白质；以及加热所述样本以完成所述蛋白质的热辅助消化。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述缓冲液为溶液中的。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述缓冲液选自由以下项组成的组：Tris、BIS
‑
Tris、MES、HEPES、三乙醇胺和三乙胺。4.根据权利要求2所述的方法，其中所述装置内的溶液的pH介于5.0和9.0之间。5.根据权利要求2所述的方法，其中所述溶液中的缓冲液进一步包含一种或多种添加剂，所述一种或多种添加剂选自由以下项组成的组：木糖醇、甲硫氨酸和CaCl2。6.根据权利要求1所述的方法，其中完全消化包括将所述蛋白质消化到小于15％的漏切。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质样本被加热并且用固定化酶进行消化，并且完全消化在10分钟内发生。8.根据权利要求1所述的方法，其中加热所述样本以利用固定化酶完成所述蛋白质的消化在5分钟内发生。9.根据权利要求1所述的方法，其中加热发生在高于45℃，优选地65℃至75℃且不高于85℃范围内的升高的温度下。10.根据权利要求9所述的方法，其中使用设备施加加热，所述设备选自由以下项组成的组：烘箱、培养箱、摇床、热混合器。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述表面涂层包括两个部分：第一涂层部分和第二涂层部分，所述第一涂层部分具有用于生物缀合的官能团，所述第二涂层部分具有减少所述蛋白质与所述固体载体表面之间的不期望的相互作用的官能团。12.根据权利要求11所述的方法，其中固定化之后的所述表面涂层包括亲水性涂层，所述亲水性涂层具有附接到其表面的固定化酶。13.根据权利要求11所述的方法，其中所述表面涂层在所述固体载体的表面上提供至少5μmol/m2的表面覆盖率。14.根据权利要求1所述的方法，其中固定化酶选自由以下项组成的组：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Lys
‑
C、胃蛋白酶、Glu
‑
C、Arg
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C、Asp N、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶、IdeS、IdeZ、PNGase F或任何组合。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶用亲水性交联基团改性以增加化学稳定性和热稳定性。16.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶用疏水性改性剂改性以增加对所述蛋白质样本的亲和力。17.根据权利要求1所述的方法，其中所述固体载体包括基于聚合物的材料、基于二氧化硅的材料、杂化材料、琼脂糖或纤维素。18.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶固定化在其上的所述固体载体是无孔的或
多孔的或磁性的，呈膜、粒子、整料、设备的表面、微芯片的表面的形式。19.根据权利要求1所述的方法，其中消化所述样本的所述蛋白质的整个过程包括在加热所述样本以完成消化之前对所述样本进行的一个或多个预处理步骤。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述一个或多个预处理步骤包括使所述样本的所述蛋白质变性、还原所述蛋白质样本、使所述蛋白质样本烷基化或使所述样本的所述蛋白质脱盐或任何组合。21.根据权利要求1所述的方法，其中加热所述样本以完成消化提供将所述蛋白质消化为具有小于约15％的漏切和大于约85％的序列覆盖率。22.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，所述方法进一步包括将消化的蛋白质提交到下游分析，所述下游分析包括液相色谱
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紫外(LC
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UV)或液相色谱
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【专利技术属性】
技术研发人员：李文静，B，
申请(专利权)人：沃特世科技公司，
类型：发明
国别省市：