磷酸前药及其活性代谢物的基于液相色谱的检测和定量制造技术

本公开涉及气相沉积涂覆的流动路径用于使用液相色谱

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】磷酸前药及其活性代谢物的基于液相色谱的检测和定量
[0001]相关申请
[0002]本申请要求于2020年5月5日提交的名称为“Liquid Chromatography Based Quantitation of Phospho Prodrugs and Their Active Metabolites”的美国临时专利申请序列号63/020,317的权益和优先权，其全部公开内容通过此引用并入本文。


[0003]本公开涉及气相沉积涂覆的流动路径用于使用液相色谱
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质谱(LC/MS)或液相色谱
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紫外检测(LC/UV)改进色谱法和样品分析的用途。更具体地，本技术涉及使用具有涂覆的流动路径的色谱装置和流体系统从样品基质(例如，哺乳动物血液、血浆)中分离和定量分析物(磷酸前药及其活性代谢物)。本公开还涉及在用于定量前药及其活性代谢物的LC
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MS或LC
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UV方法中提供改进的回收率、峰形状和动态范围的方法。

技术介绍

[0004]核酸聚合酶是催化遗传信息的复制和转录的酶。由于它们起到这种关键的生物学作用，因此它们也是非常重要的可成药靶标就不奇怪了。病毒聚合酶与人类聚合酶之间的结构差异已经给出了有效抗病毒治疗的希望。存在许多不同类型的病毒，但每种病毒都会在DNA基因组或RNA基因组中储存遗传信息。因此，病毒DNA或RNA聚合酶可以用底物类似物靶向以抑制生产性复制。在一般复制事件中，底物是核苷酸三磷酸，诸如三磷酸腺苷(ATP)。另选地，可以用核苷酸类似物给药以破坏重要事件，如链终止。
[0005]在SARS
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CoV
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2(即，COVID
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19)的情况下，RNA聚合酶负责基因组复制。两种在体外对新型冠状病毒具有良好疗效的抗病毒药物正在对患者进行测试。一种是法匹拉韦(6
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氟
‑3‑
羟基
‑2‑
吡嗪甲酰胺)，其为经代谢成法匹拉韦
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呋喃核糖基
‑5′‑
三磷酸(法匹拉韦
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RTP)的核碱基类似物和前药。据认为，磷酸核糖转移酶负责药物的细胞活化。在其三磷酸活化形式中，磷酸核糖转移酶成为病毒(诸如流感和埃博拉)中的RNA复制的有效效应物(即，聚合酶抑制剂)。法匹拉韦有望抑制SARS
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CoV
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2的复制，并且全球正在进行多项患者试验。另一种用于SARS
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CoV
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2治疗的可行药物是瑞德西韦，其为在细胞内转化为活性三磷酸形式的磷酰胺前药。这些抗病毒药物和其他类似药物的前景已经导致了新临床研究的爆炸式增长。
[0006]在临床试验中，在整个剂量方案中紧密监测患者以收集关于所谓的药代动力学概况和药效学概况的信息。在同情性使用研究药物的情况下，也经常对患者进行监测，以避免亚治疗性用药并避免毒性血浆浓度。在两种情况下，定期获取血液样品，并且进行测定以测量所施用药物的浓度并且观察其对身体的影响，包括受试者体内产生的活性代谢物的量。在两种情况下，可以采用酶联免疫吸附测定。
[0007]在一些情况下，感兴趣的是借助于与光学检测或与质谱配对的液相色谱来监测生物转化事件。迄今为止，核苷酸类似物在很大程度上是使用离子配对试剂(如三丁胺)分离的。这用于改进亲水性、酸性分析物的保留，并且抑制基于有问题的金属吸附的样品损失。另一方面，强离子配对试剂(如三丁胺)可以抑制电离并且使切换回其他LC
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MS技术成为挑
战。
[0008]但最终，仍然需要加快这些测定的周转速度，并使其更加可靠和稳健。例如，磷酸前药及其代谢物与金属部件相互作用，这导致在其通过液相色谱进行分离和分析时面临已知的挑战(例如，次级相互作用)。期望具有分散程度最低的高效色谱系统，这要求流动路径的直径减小并且能够承受越来越快的流速下的越来越高的压力。因此，色谱流动路径选择的材料本质上通常是金属的。尽管存在以下事实：已知某些分析物(例如，生物分子、蛋白质、聚糖、肽、寡核苷酸、阴离子代谢物和两性离子如氨基酸和神经递质)的特性与金属表面具有不利的相互作用(所谓的色谱次级相互作用)。
[0009]所提出的用于金属特异性结合相互作用的机制需要理解路易斯酸碱化学理论。纯金属和金属合金(连同它们的对应氧化物层)具有末端金属原子，该末端金属原子具有路易斯酸特性。更简单地，这些金属原子示出接受供体电子的倾向。对于带有正电荷的任何表面金属离子而言，这种倾向甚至更为明显。具有足够的路易斯碱特性的分析物(可提供非成键电子的任何物质)可潜在地吸附到这些位点，从而形成有问题的非共价络合物。正是这些物质被定义为与金属相互作用的分析物。
[0010]例如，具有磷酸酯基团的分析物是能够进行高亲和力金属螯合的优异的多齿配体。这种相互作用导致磷酸化物质与流动路径金属结合，从而减少检测到的此类物质的量，这是特别麻烦的效应，因为磷酸化物质常常是测定中最重要的分析物。为了使检测和监测磷酸前药及其活性代谢物更加可靠和稳健，必须考虑与金属色谱表面的次级相互作用。
[0011]另外，需要实现对前药及其磷酸化代谢物的检测和定量的更大选择性。
[0012]因此，需要不断努力研究分析物与金属色谱表面的次级色谱相互作用，以促进具有较高分辨率的色谱分离，尤其是在关键的药代动力学概况和药效学概况以及前药治疗开发方法中。

技术实现思路

[0013]通常，本技术涉及用于通过有利地使用气相沉积涂覆的LC表面来基于LC的检测和/或定量磷酸前药及其活性代谢物(例如，磷酸化代谢物)的方法。在一些实施方案中，磷酸前药的活性代谢物导致抑制RNA的转录，这对治疗哺乳动物体内的病毒可能是有用的。
[0014]本技术还可以以允许改进的检测和/或定量磷酸前药诸如例如瑞德西韦的方法和装置为特征。本技术还可以用于检测和定量瑞德西韦及其磷酸化代谢物。也就是说，本技术可以用于确定样品中存在的瑞德西韦及其活性代谢物的存在和/或浓度。本技术使用通过色谱装置沿着润湿流体路径的至少一些部分的烷基甲硅烷基涂层并结合使用混合模式固定相的组合。作为此组合的结果，不需要在分离中使用离子配对试剂，这允许更好(例如，更高分辨率或分离)或更快、更容易地利用检测器，诸如待结合在本方法中的光学检测器。离子配对试剂是不包括铵的碱，该碱含有一个或多个含C2至C18的取代基，并且在流动相的条件下是阳离子型的。用于聚合酶抑制剂的活性代谢物的示例离子配对试剂包括但不限于三乙胺、二异丙基乙胺、辛胺、乙胺、丁胺、三丁胺或异丙胺。
[0015]聚合酶抑制剂是通过干扰病毒用于复制(例如，建立其自身的遗传物质)的酶作用而抵抗病毒的药物。前药是在施用于患者/受试者时呈非活性形式，但是在体内(例如，在血液中)转化为活性化合物的药物。在一种情况下，转化为活性化合物是合成代谢反应产生或
积聚一种或多种代谢物的结果。在另一种情况下，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种检测样品中的瑞德西韦的方法，所述方法包括：将样品提供给容纳设置在其中的混合模式固定相的色谱柱，所述色谱柱包括覆盖所述色谱柱的润湿内表面的至少一部分的烷基甲硅烷基涂层；通过施加包含乙酸铵的流动相溶液的梯度从所述样品中分离和洗脱瑞德西韦；以及使用质谱检测器或光学检测器检测洗脱液中的瑞德西韦。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述流动相溶液不包含离子配对试剂。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述流动相溶液具有在4.8至7范围内的pH。4.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括使用所述质谱检测器或所述光学检测器检测所述洗脱液中的瑞德西韦的一种或多种磷酸化代谢物。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述梯度是线性梯度。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述梯度通过变更乙酸铵的浓度来实现。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述梯度通过变更乙腈的浓度来实现。8.根据权利要求7所述的方法，其中乙腈的浓度在0体积百分比至60体积百分比的范围内。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述烷基甲硅烷基涂层包含双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷。10.一种用于分析包含磷酸前药的样品的色谱柱，所述柱包括：金属主体，所述金属主体具有限定从所述柱的入口至出口的流动路径的内表面；混合模式固定相，所述混合模式固定相具有反相/阴离子交换混合模式化学物质，所述混合模式固定相容纳在所述流动路径内，不同于所述金属主体，并且用至少一个熔块固定在所述金属主体内；以及烷基甲硅烷基涂层，所述烷基甲硅烷基涂层覆盖所述至少一个熔块。11.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：沃特世科技公司，
类型：发明
国别省市：