一种用京尼平超灵敏测定蛋白质浓度的方法技术

本发明专利技术公开了一种用京尼平超灵敏测定蛋白质浓度的方法，该方法采用天然产物京尼平作为试剂，将梯度稀释后的蛋白标准样品分别与京尼平试剂溶液混合，孵育后用分光光度计检测吸光度，制作蛋白质浓度与吸光度的标准曲线；将待测定的未知浓度蛋白样品溶液与京尼平试剂溶液混合，孵育后用分光光度计检测吸光度，根据制作的标准曲线确定样品溶液中蛋白质的浓度。该方法灵敏度高，实验重复性好，蛋白浓度测定范围更大，最小可精确到1.0μg/mL，且不受到蛋白氨基酸组成的影响，去除了蛋白样品溶液中存在的各种干扰试剂。存在的各种干扰试剂。存在的各种干扰试剂。

【技术实现步骤摘要】
一种用京尼平超灵敏测定蛋白质浓度的方法


[0001]本专利技术属于生物技术的应用
，具体涉及一种用京尼平超灵敏测定蛋白质浓度的方法。

技术介绍

[0002]蛋白浓度测定是蛋白生物技术(包括生物制药中蛋白药物)实验中一项基本实验内容，它是进行SDS
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PAGE电泳、Western Blot、Elisa、蛋白酶活性测定、蛋白二维电泳、蛋白质谱、蛋白分子量测定、蛋白测序等实验的基本前提，比较常见的为蛋白浓度测定方法包括Lowry法，Bradford法，BCA法，UV法等。
[0003]Lowry开发了碱性铜处理后用福林酚试剂测量蛋白质的方法。蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu
2+
螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。Lowry分析法灵敏度高，易于应用于微孔板，但耗时长，易受多种干扰化合物的影响。Bradford分析法是一种经典方法，考马斯亮蓝G
‑
250染料选择性结合精氨酸和芳香残基，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。在一定的蛋白浓度范围内，蛋白浓度与吸收值呈线性增长。Bradford分析法灵敏度远高于Lowry法，但由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，且仍有一些物质干扰此方法的测定。BCA(Bicinchoninic acid)分析具有很高的灵敏度，但成本高、难度大且涉及大量试剂。此外，BCA分析需要大约10分钟的吸收时间才能得到可靠的结果。紫外线(UV)吸收是最常用的方法。其优点为该方法简单、廉价、样品可回收且快速，但被认为是灵敏度最低的方法。此外，它很容易受到缓冲成分和核酸的干扰。
[0004]以上四种测量方法仍能够测量蛋白蛋白浓度，但仍然存在以下问题，操作仍然不够简单，测量过程不够迅速，测量结果不够敏感，操作过程不够安全。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种用京尼平超灵敏测定蛋白质浓度的方法。该方法采用天然产物京尼平作为试剂，相较于现有测定试剂，毒性更小。京尼平为无色物质，是从栀子体内组织中提取的栀子苷，可以自发地与蛋白质、胶原、明胶、壳聚糖发生交联，且京尼平和蛋白的交联样品具有很强的荧光特性，与蛋白结合产生的荧光灵敏度更高，实验重复性更好，蛋白浓度测定范围更大，最小可精确到1.0μg/mL，且不受到蛋白氨基酸组成的影响，去除了蛋白样品溶液中存在的各种干扰试剂。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种用京尼平超灵敏测定蛋白质浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0007]步骤一、用酒精溶液制备京尼平试剂溶液；
[0008]步骤二、采用缓冲溶液梯度稀释蛋白标准样品，将梯度稀释后的蛋白标准样品分
别与步骤一中制备的京尼平试剂溶液混合，孵育后用分光光度计检测吸光度，制作蛋白质浓度与吸光度的标准曲线；
[0009]步骤三、采用缓冲溶液制备待测定的未知浓度蛋白样品溶液，然后将待测定的未知浓度蛋白样品溶液与步骤一中制备的京尼平试剂溶液混合，孵育后用分光光度计检测吸光度，根据步骤二中制作的标准曲线确定样品溶液中蛋白质的浓度。
[0010]上述的一种用京尼平超灵敏测定蛋白质浓度的方法，其特征在于，步骤一中所述酒精溶液的质量浓度为50％。
[0011]上述的一种用京尼平超灵敏测定蛋白质浓度的方法，其特征在于，步骤二和步骤三中所述孵育的温度均为55℃～100℃，孵育的时间均为0.5h～16h。
[0012]上述的一种用京尼平超灵敏测定蛋白质浓度的方法，其特征在于，步骤二和步骤三中所述孵育的温度均为80℃～100℃，孵育的时间均为2h～16h。
[0013]上述的一种用京尼平超灵敏测定蛋白质浓度的方法，其特征在于，步骤二和步骤三中所述缓冲溶液的pH值均为5～9。
[0014]上述的一种用京尼平超灵敏测定蛋白质浓度的方法，其特征在于，步骤二和步骤三中所述缓冲溶液的pH值均为7～8。
[0015]上述的一种用京尼平超灵敏测定蛋白质浓度的方法，其特征在于，步骤二和步骤三中所述分光光度计的检测波长为570nm～630nm。
[0016]上述的一种用京尼平超灵敏测定蛋白质浓度的方法，其特征在于，步骤二和步骤三中所述分光光度计的检测波长为590nm。
[0017]本专利技术与现有技术相比具有以下优点：
[0018]1、本专利技术采用天然产物京尼平作为试剂，相较于现有测定试剂，毒性更小。京尼平为无色物质，是从栀子体内组织中提取的栀子苷，可以自发地与蛋白质、胶原、明胶、壳聚糖发生交联，且京尼平和蛋白的交联样品具有很强的荧光特性，与蛋白结合产生的荧光灵敏度更高，实验重复性更好。
[0019]2、本专利技术方法蛋白浓度测定范围更大，最小可精确到1.0μg/mL。
[0020]3、本专利技术的方法不受到蛋白氨基酸组成的影响，去除了蛋白样品溶液中存在的各种干扰试剂。
[0021]下面结合附图和实施例，对本专利技术的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
[0022]图1为京尼平的结构式。
[0023]图2为本专利技术实施例1不同激发波长下，京尼平、蛋白样品及其混合物的紫外吸收。
[0024]图3为本专利技术实施例2不同pH值下蛋白质与京尼平反应的吸光度曲线。
[0025]图4为本专利技术实施例3蛋白样品和京尼平在不同温度下的吸光度变化趋势。
[0026]图5为本专利技术实施例4、5和6京尼平与三种不同蛋白质样品(a，白蛋白组分；b，明胶；c，精氨酸)反应的标准曲线。
[0027]图6为本专利技术实施例8的京尼平与重组胶原蛋白样品反应的标准曲线。
具体实施方式
[0028]材料：
[0029]重组类人胶原蛋白CF
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1552(HLC,西安巨子生物基因技术股份有限公司)、京尼平(经高效液相色谱测定纯度＞98％)(日本和光纯药工业株式会社)、牛血清白蛋白(BSA)(罗氏公司)、卵清蛋白(CAS:A5503；美国Sigma
‑
Aldrich)、明胶、分光光度计Gen5及其配套耗材。
[0030]实施例1：相同吸收波长下，水(空白对照)、HLC、京尼平、京尼平与HLC混合物的吸收值差异
[0031]分别配制浓度均为5mg/mL的HLC溶液和京尼平溶液，在400
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600nm波长下分别测定水、HLC、京尼平、京尼平与HLC混合物的吸收峰，结果如图2所示，京尼平与胶原蛋白混合物有着很强的荧光特性在605nm处有最大吸收。因此，可以使用这一特性来量化溶液中的蛋白质浓度。
[0032]实施例2：pH值对京尼平与蛋白质影响
[0033]京尼平用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用京尼平超灵敏测定蛋白质浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、用酒精溶液制备京尼平试剂溶液；步骤二、采用缓冲溶液梯度稀释蛋白标准样品，将梯度稀释后的蛋白标准样品分别与步骤一中制备的京尼平试剂溶液混合，孵育后用分光光度计检测吸光度，制作蛋白质浓度与吸光度的标准曲线；步骤三、采用缓冲溶液制备待测定的未知浓度蛋白样品溶液，然后将待测定的未知浓度蛋白样品溶液与步骤一中制备的京尼平试剂溶液混合，孵育后用分光光度计检测吸光度，根据步骤二中制作的标准曲线确定样品溶液中蛋白质的浓度。2.根据权利要求1所述的一种用京尼平超灵敏测定蛋白质浓度的方法，其特征在于，步骤一中所述酒精溶液的质量浓度为50％。3.根据权利要求1所述的一种用京尼平超灵敏测定蛋白质浓度的方法，其特征在于，步骤二和步骤三中所述孵育的温度均为55℃～10...

【专利技术属性】
技术研发人员：段志广，郭梦迪，李娜，朱晨辉，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：