本发明专利技术提供血清中7种游离甾体激素质谱检测试剂盒及检测方法，包括样本与试剂包A中的试剂A混合，静置，混合后转移至试剂包C中的超滤离心管内超滤，滤液转移至离心管，加入试剂包B中的内标，涡旋混匀，静置，加入试剂包A中的试剂B，涡旋混匀，静置，高速离心。取上清液，冻干，加入试剂包A中的试剂D，涡旋，衍生，并恢复至室温，冻干，加入试剂包A中的试剂C，涡旋，所制备样本上机分析。应用超高效液相色谱质谱联用系统，在C18反相色谱柱上，实现7种游离甾体激素在色谱柱上的分离，经分离的7种游离甾体激素进入质谱系统检测。本发明专利技术提供了一种准确高效的血清中7种游离甾体激素同时检测的质谱检测试剂盒及检测方法。检测试剂盒及检测方法。检测试剂盒及检测方法。
【技术实现步骤摘要】
血清中7种游离甾体激素质谱检测试剂盒及检测方法
[0001]本专利技术涉及质谱检测
，具体为一种血清中7种游离甾体激素质谱检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
[0002]甾体激素是人体内最重要的内源性代谢物种类之一，在维持第二性征、调控基因转录、调节内分泌与免疫功能等方面发挥着至关重要的作用。激素在人体内有存在方式有两种，一种是与蛋白结合形式，一种是游离状态。众多研究表明循环血液中小部分的游离甾体激素是实现激素生物效应的主要部分，生物体内与蛋白结合的激素与游离甾体激素间的关系非常复杂，但某些生理因素和(或)药物治疗能够影响与蛋白结合激素和游离甾体激素的浓度，这种情况下，测定游离甾体激素比测定总激素能够更好的判断生物活性的状态。
[0003]目前研究报导血清中甾体激素检测方法大部分为总激素的含量检测，总激素含量检测方法相对比较成熟，但游离甾体激素检测的报导较少，多种游离甾体激素的同时检测能够更加全面有效的评估人体与其相关的代谢状态，对于研究疾病的发生发展机制和个体对疾病的应答具有重要的作用。目前游离甾体激素检测报导仅限于单一游离甾体激素(游离睾酮等)的检测，未见血清中多种游离甾体激素同时检测的相关文献报导。由于血清中游离甾体激素含量极低，需要建立灵敏度高且稳健的前处理及检测方法。目前单一游离甾体激素检测前处理均采用血清样本经超滤管超滤、液液萃取后直接上机分析，该方法检测灵敏度较低，能够检出的游离甾体激素数量很少。
[0004]目前游离甾体激素的检测还处于实验室研究阶段，没有相应的产品支持，无法应用于实际临床样本检测，试剂盒产品的推出能够很大程度上支持多种游离甾体激素临床检测的发展。
[0005]为了解决上述问题，本案由此而生。
技术实现思路
[0006](一)解决的技术问题
[0007]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种血清中7种游离甾体激素质谱检测试剂盒及检测方法，解决了上述
技术介绍
中提出的问题。
[0008](二)技术方案
[0009]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种血清中7种游离甾体激素质谱检测试剂盒，包括血清样本前处理过程应用试剂的试剂包A，作为校准品、内标及质控使用的试剂包B，作为前处理样本超滤和进样使用的试剂包C，试剂包A中包括试剂A、试剂B试剂C、试剂D，试剂包B包括定量使用的校准品、内标和进行质量控制的质控品，试剂包C包括0.5mL超滤离心管、2mL进样瓶、300μL内衬管。
[0010]优选的，试剂A为HEPPS缓冲溶液，试剂B为甲基叔丁基醚，试剂C为30％甲醇水，试剂D为盐酸羟胺甲醇溶液。
[0011]优选的，HEPPS缓冲溶液pH在7.2～7.4之间，浓度为238.3g/L，所述的盐酸羟胺甲醇溶液为盐酸羟胺浓度为0.1mol/L。
[0012]优选的，试剂包B包括定量使用的校准品、内标和进行质量控制的质控品，校准品由一定浓度的7种激素的混合标准溶液制备而成，浓度控制在S1
‑
S6之间；内标由各激素内标标准物质混合溶液制备而成，浓度为0.5ng/mL；质控品包括低质控和高质控，所述低质控和高质控均为牛血清白蛋白缓冲液中加入7种激素的混合标准溶液制备而成，所述低质控浓度控制在线性S3浓度，所述高质控浓度控制在线性S5浓度。
[0013]优选的，牛血清白蛋白缓冲液中的缓冲液为PBS缓冲液，其pH在7.2～7.4之间,牛血清白蛋白浓度为5％。
[0014]一种血清中7种游离甾体激素质谱检测方法，包括如下步骤：
[0015](1)血清样本前处理：包括血清样本稀释，超滤，萃取，衍生，所制备的样本作为高效液相色谱质谱分析备用；
[0016](2)校准品前处理：将所述(1)血清样本前处理中的血清样本更换为相同体积的校准品(S1
‑
S6)，前处理方法同所述(1)血清样本前处理方法。所制备样本作为高效液相色谱质谱分析备用；
[0017](3)质控品前处理：将所述(1)血清样本前处理中的血清样本更换为相同体积的质控品，其中质控品包括低质控和高质控，前处理方法同所述(1)血清样本前处理方法，所制备样本作为高效液相色谱质谱分析备用；
[0018](4)超高效液相色谱分离：应用超高效液相色谱系统，在C18反相色谱柱上，在特定的流动相组成、流动相梯度、流速、柱温和进样体积条件下，实现7种游离甾体激素在C18反相色谱柱上的分离；
[0019](5)串联四级杆质谱检测：经分离的7种游离甾体激素进入质谱系统检测，正离子模式，特定的离子源参数及MRM参数，实现7种游离甾体激素的质谱检测。
[0020]优选的，步骤(1)稀释为：移取试剂包A中试剂A 200μL于1.5mL离心管内，移取200μL样本加入该离心管内，涡旋混匀1min，置于37℃恒温干燥箱中20min静置。超滤为：将该离心管中液体全部转移至试剂包C中0.5mL超滤离心管中，以1800g，37℃条件离心1h。萃取为：离心结束后，转移200μL滤液至2mL离心管内，加入20μL试剂包B中的内标，涡旋1min混匀，于室温条件下静置5min。向上述2mL离心管内加入1.3mL试剂包A中的试剂B，涡旋10min，置于台式高速离心机以13000rpm 4℃离心5min。衍生为：移取1000μL上清液于1.5mL离心管中，于真空冷冻干燥机内冻至全干(或氮气吹干)，冻干(吹干)结束后，于离心管内加入50μL试剂包A中的试剂D，涡旋30s，于电热恒温水槽中60℃水浴20min。水浴结束，取出离心管冷却至室温，于真空冷冻干燥机内冻干(吹干)，后加入70μL试剂包A中的试剂C，涡旋5min。
[0021]优选的，步骤(4)中C18色谱柱为Agilent Proshell 120EC
‑
C18 3.0
×
50mm 2.7μm；流动相A为0.1％甲酸/水溶液，流动相B为0.1％甲酸/乙腈溶液；流动相梯度为流动相B，0
‑
1.5min，30
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45％，1.5
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2.5min，45
‑
55％，2.5
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3min，55
‑
100％，3
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4min，100％，4
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4.1min，100
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30％，4.1
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5min，30％；流速为0.4mL/min；柱温为40℃；进样量为10μL。
[0022]优选的，步骤(5)中毛细管电压500V，锥孔电压30V，脱溶剂温度500℃，脱溶剂气1000L/Hr，锥孔气150L/Hr，离子源温度150℃，采用MRM模式，每个化合物两个离子对，分别用于定性和定量。
[0023](三)有益效果
[0024]采用上述技术方案后，本专利技术与现有技术相比，具备以下优点：本专利技术通过超滤离心管将血清中的游离甾体激素分离后，对分离出的游离甾体激素进行液液萃取，对萃取后的样本进本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种血清中7种游离甾体激素质谱检测试剂盒，其特征在于，包括血清样本前处理过程应用试剂的试剂包A，作为校准品、内标及质控使用的试剂包B，作为前处理样本超滤和进样使用的试剂包C，试剂包A中包括试剂A、试剂B试剂C、试剂D，试剂包B包括定量使用的校准品、内标和进行质量控制的质控品，试剂包C包括0.5mL超滤离心管、2mL进样瓶、300μL内衬管。2.根据权利要求1所述的血清中7种游离甾体激素质谱检测试剂盒，其特征在于：试剂A为HEPPS缓冲溶液，试剂B为甲基叔丁基醚，试剂C为30％甲醇水，试剂D为盐酸羟胺甲醇溶液。3.根据权利要求2所述的血清中7种游离甾体激素质谱检测试剂盒，其特征在于：HEPPS缓冲溶液pH在7.2～7.4之间，浓度为238.3g/L，所述的盐酸羟胺甲醇溶液为盐酸羟胺浓度为0.1mol/L。4.根据权利要求1所述的血清中7种游离甾体激素质谱检测试剂盒，其特征在于：试剂包B包括定量使用的校准品、内标和进行质量控制的质控品，校准品由一定浓度的7种激素的混合标准溶液制备而成，浓度控制在S1
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S6之间；内标由各激素内标标准物质混合溶液制备而成，浓度为0.5ng/mL；质控品包括低质控和高质控，所述低质控和高质控均为牛血清白蛋白缓冲液中加入7种激素的混合标准溶液制备而成，所述低质控浓度控制在线性S3浓度，所述高质控浓度控制在线性S5浓度。5.根据权利要求4所述的血清中7种游离甾体激素质谱检测试剂盒，其特征在于：牛血清白蛋白缓冲液中的缓冲液为PBS缓冲液，其pH在7.2～7.4之间,牛血清白蛋白浓度为5％。6.一种血清中7种游离甾体激素质谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)血清样本前处理：包括血清样本稀释，超滤，萃取，衍生，所制备的样本作为高效液相色谱质谱分析备用；(2)校准品前处理：将所述(1)血清样本前处理中的血清样本更换为相同体积的游离皮质醇、游离皮质酮、游离11
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脱氧皮质醇、游离雄烯二酮、游离脱氢表雄酮、游离脱氢表雄酮硫酸酯、游离睾酮的校准品，前处理方法相同于所述(1)血清样本前处理方法，所制备样本作为高效液相色谱质谱分析备用；(3)质控品前处理：将所述(1)血清样本前处理中的血清样本更换为相同体积的质控品，其中质控品包括低质控和高质控，前处理方法同所述(1)血清样本前处理方法，所制备样本作为高效液相色谱质谱分析备用；(4)超高效液相色谱分离：应用超高效液相色谱系统，在C18反相色谱柱上，在特定的流动相组成、...
【专利技术属性】
技术研发人员：马良，许佳彬，李承达，章燕露，陈佳，拓文娟，
申请(专利权)人：杭州汉库医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：
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