一种采用免标记单粒子成像技术快速检测低浓度细菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种采用免标记单粒子成像技术快速检测低浓度细菌的方法，通过跟踪粒子在自由溶液中的运动，再根据粒子在溶液中布朗运动时散射截面的变化来区分单个粒子的形态异质性，这有助于以免标记的方式从复杂的基质中识别单个细菌。此外为了提高单粒子检测的灵敏度，通过诱导自由溶液的对流可实现在反射增强暗场显微镜的小视场中快速、方便地筛选低浓度的细菌。通过这种方式，我们能够子在十分钟内(包括两分钟的样品预处理和5分钟的筛选)将GBS阳性样本和阴性样本区分开来，这是我们所知的检测GBS细菌最快的方法。与现有技术相比，本发明专利技术检测速度快、准确率高、操作简单和成本低，将可能在传染病控制中找到更多潜在的应用。用。用。

【技术实现步骤摘要】
一种采用免标记单粒子成像技术快速检测低浓度细菌的方法


[0001]本专利技术涉及临床样本中低浓度细菌超快检测
，特别涉及一种采用免标记单粒子成像技术快速检测低浓度细菌的方法。

技术介绍

[0002]细菌是自然界中数量最多、分布广泛和形态多样的一类微生物。细菌感染和病毒感染约占人类所有致病性疾病的70％，且细菌感染是导致人死亡的主要原因之一，它对人类的健康和社会的危害巨大。抗生素的治疗通常是用来解决细菌感染的方法，但是近年来随着抗生素使用的增多，具有抗生素耐药性的细菌菌株的出现正在增加，这使得临床上可使用抗生素的选择性降低，细菌性疾病治疗失败率逐渐升高，并导致发病率和死亡率增高及医疗费用的增加，因此，早期快速识别细菌并合理使用抗生素对防止抗生素的滥用至关重要。如B族链球菌(Group B Streptococcus，GBS)是一种兼性厌氧型革兰氏阳性球菌，通常寄居于阴道和直肠，也是引起绒毛羊膜炎和新生儿败血症的主要原因。在怀孕期间约有10％－40％的女性有GBS感染，而携带GBS的孕妇在分娩过程中有40％－70％的可能会将该病菌传染给新生儿，导致新生儿早期的感染，从而引起脑膜炎、肺炎、败血症等早发性疾病(Early－Onset Disease，EOD)，甚至死亡。即使在感染后存活的新生儿，也可能有严重的的神经系统后遗症，如癫痫、精神运动发育障碍、严重智力迟钝、失明和耳聋等。因此，GBS感染是引起新生儿致病甚至死亡的重要原因之一。
[0003]携带有GBS细菌的孕妇是否会将GBS传染给新生儿，与产妇分娩时的健康状况有关，且呈动态变化，产前GBS检测结果与分娩过程中的检测结果没有很强的相关性。目前临床上对于待产孕妇大都采用抗生素干预来预防新生儿GBS的感染，该方法虽然可以预防新生儿GBS的感染，但同样会造成抗生素的滥用。因此，在早期快速识别和检测致病菌对疾病控制和精准医疗至关重要，这有助于在不滥用抗生素的情况下进行恰当的治疗，不仅可以挽救生命，还可以大大降低由耐药性细菌所传播的疾病带来的医疗费用。
[0004]目前对于细菌的检测方法主要有细菌培养法和核酸扩增检测法(又称聚合酶链反应，Polymerase Chain Reaction，PCR)。虽然细菌培养法是GBS检测最基本的方法，该方法成本较低、结果可靠、灵敏度高，但是耗时较长，往往需要24到72小时才能得到检测结果，这会影响医生对疾病的及时诊断治疗，可能造成病情延误。PCR方法虽然检测灵敏度高、耗时短(＞1小时)，但该方法成本高，且在临床诊断中很难及时得到检测结果。拉曼光谱法、荧光法、电化学发光法等方法也被提出用于细菌的检测。但它们的操作通常很复杂，又由于目标细菌含量低，且临床样本中基质比较复杂，往往需要长时间的样品预处理和信号放大。又由于GBS感染的发病机制主要发生在分娩过程中，在分娩过程的短时间窗口(几分钟)内快速筛查GBS对临床病例至关重要，但目前还没有相关技术能够实现。因此，亟需开发一种快速、灵敏的细菌检测技术，实现GBS细菌的快速现场检测。

技术实现思路

[0005]针对
技术介绍
指出的现有临床样本中细菌检测技术的缺点，本专利技术的目的在于提出一种采用免标记单粒子成像技术快速检测低浓度细菌的方法，该方法是一种操作简单，检测速度快且灵敏度高的细菌检测技术，可实现细菌的超快速和高灵敏现场检测。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供一种采用免标记单粒子成像技术快速检测低浓度细菌的装置。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术提供一种采用免标记单粒子成像技术快速检测低浓度细菌的方法，由于粒子形状的不均一性，使得粒子在溶液中布朗运动时处在不同散射截面时产生不同的散射强度，可以根据不同粒子散射强度的波动范围来直接鉴定细菌的形貌。因此，该方法可以根据粒子形貌的各向异性所产生不同散射强度波动来直接鉴定细菌，还可根据粒子的大小所产生不同的光斑特征来进一步提高细菌筛选的准确性。为了克服单粒子成像中小视野范围的限制，使得检测限较高的缺点，再通过诱导样品溶液的对流来实现小视野中低浓度细菌的快速筛选来提高其检测灵敏度。
[0008]本专利技术方法可实现细菌的超快速和高灵敏检测。考虑到光学成像的方法操作简单和检测速度快的优点，本专利技术通过改善光学成像中由于光的衍射极限无法从形态直接识别细菌和受光学成像中小视野范围的影响，使得其检测限保持在较高的水平的限制。
[0009]作为一种优选技术方案，该方法包括以下步骤：将待测样品溶液盛装于一个“三明治”结构的池子中，所述的“三明治”结构的池子以抛光硅片作为基底、中间是中空透明的聚二甲基硅氧烷(PDMS)池，顶部设一个玻璃盖玻片，在反射增强暗场显微镜下使用汞灯光源获得粒子的暗场散射图像；
[0010]在所述抛光硅片两端的底部分别放置两个加热片，其中一个加热片在通电后会被加热，另一个加热片不通电，以诱导池子底部溶液的水平对流，实现细菌的快速筛查。
[0011]进一步优选的，通过引入抛光硅片作为反射面，采用反射增强暗场显微镜提高其检测灵敏度，同时使用50倍暗场物镜和CMOS相机实时记录在150
×
150μm的视场下进入视野中粒子的散射图像。
[0012]所述的反射增强暗场显微镜带有长焦距物镜，景深大，能够实现自由溶液中更多颗粒的清晰成像。
[0013]本专利技术方法中所述自由溶液中的粒子散射强度取决于粒子的散射截面，自由溶液中散射强度的波动反映了粒子形貌的不均匀性，能够根据粒子形态的异质性所产生不同散射强度的波动来直接鉴定细菌。除了根据粒子形貌异质性所产生不同散射强度的波动来筛选细菌外还可根据粒子的大小来筛选细菌。由于对直径＞1μm的粒子而言其粒子暗场成像光斑的强度分布不是高斯形状而是中心有轻微的强度塌陷，因此可根据直径＞1μm球形颗粒所具有的光斑特征进一步提高细菌筛选的准确性。在靠近池子一端的底部分放置加热片可诱导自由溶液的水平对流，可实现小视野中更多细菌筛选以提高检测灵敏度。
[0014]进一步优选的，所述的聚二甲基硅氧烷池是将二甲基硅氧烷单体和二甲基硅氧烷固化剂以质量比10：1混合并搅拌均匀，注入至胶体模具内，然后真空干燥后得到的中空透明容器。优选的，在真空干燥箱内干燥6小时，干燥完毕后开模并取得中空透明容器。
[0015]为了实现上述目的，本专利技术还提供一种采用免标记单粒子成像技术快速检测低浓度细菌的装置，该装置为一个“三明治”结构的池子中，所述的“三明治”结构的池子以抛光
硅片作为基底、中间是中空透明的聚二甲基硅氧烷(PDMS)池，顶部设一个玻璃盖玻片，在反射增强暗场显微镜下使用汞灯光源获得粒子的暗场散射图像；将该池子放置在反射增强暗场显微镜下可实时观察和记录溶液中的细菌；
[0016]在所述抛光硅片两端的底部分别放置两个加热片，其中一个加热片在通电后会被加热，另一个加热片不通电，以诱导池子底部待测样品溶液的水平对流，实现细菌的快速筛查。
[0017]本专利技术装置，在反射增强暗场显微镜上使用抛光硅片作为基底，使用汞灯光源作为细菌的暗场成像光本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种采用免标记单粒子成像技术快速检测低浓度细菌的方法，其特征在于，该方法根据粒子形貌的各向异性所产生不同散射强度波动来直接鉴定细菌，还根据粒子的大小所产生不同的光斑特征来进一步提高细菌筛选的准确性，再通过诱导样品溶液的对流来实现小视野中低浓度细菌的快速筛选来提高检测灵敏度。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：将待测样品溶液盛装于一个“三明治”结构的池子中，所述的“三明治”结构的池子以抛光硅片作为基底、中间是中空透明的聚二甲基硅氧烷(PDMS)池，顶部设一个玻璃盖玻片；在反射增强暗场显微镜下使用汞灯光源获得粒子的暗场散射图像；在所述抛光硅片两端的底部分别放置两个加热片，其中一个加热片在通电后会被加热，另一个加热片不通电，以诱导池子底部溶液的水平对流，实现细菌的快速筛查。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，通过引入抛光硅片作为反射面，采用反射增强暗场显微镜提高其检测灵敏度，同时使用50倍暗场物镜和CMOS相机实时记录在150
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150μm的视场下进入视野中粒子的散射图像。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的反射增强暗场显微镜带有长焦距物镜，景深大，能够实现自由溶液中更多颗粒的清晰成像。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的聚二甲基硅氧...

【专利技术属性】
技术研发人员：方一民，陈珊，王鹏程，孙俊杰，郑玉皓，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：