一种改性高岭土固定化芘降解菌剂的制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种改性高岭土固定化芘降解菌剂的制备方法：将筛选获得的芘降解功能菌株接种于LB液体培养基中，置于恒温摇床中振荡进行活化培养，所得菌液经离心机离心后，收集底部菌体即得活化浓缩菌液；将活化浓缩菌液和酸改性高岭土依次加入到无菌LB液体培养基中培养；培养结束后，经离心机离心处理后，收集底部固体物进行冷冻干燥，获得粉末状固定化菌剂，置于冰箱内保存，即得改性高岭土固定化芘降解菌剂。本发明专利技术制备的改性高岭土固定化芘降解菌剂对多环芳烃污染土壤修复效果显著，菌株固定牢固，且反应温和、成本低廉、无二次污染，具有广阔的工程化应用前景。具有广阔的工程化应用前景。具有广阔的工程化应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种改性高岭土固定化芘降解菌剂的制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及一种改性高岭土固定化芘降解菌剂的制备方法与应用，属于污染土壤微生物修复


技术介绍

[0002]石油烃污染是当前土壤污染的重点问题，石油烃具高毒性，通过生物富集和食物链传递的方式，对人体健康构成威胁。通常，石油烃进入土壤环境后会破坏土壤结构和微生物群落组成，造成土壤肥力下降。其中高沸点组分可与土壤有机质结合，并老化形成微生物难以利用的结合态化合物，可在土壤环境中长期稳定存在，但也会随着环境条件(如pH和氧化还原电位)的改变而重新释放，对土壤生态系统造成影响。石油烃对土壤生态系统具有毒性效应，导致微生物多样性和丰度降低，影响土壤微生物对石油烃的降解效能。芘是典型的多环芳烃，作为石油烃污染中难降解物质之一，往往顽固存在于土壤环境中，造成持久性的危害。
[0003]在前期工作中，专利技术人从石油烃污染土壤中筛分获得一株芘降解功能菌株，通过16S rDNA测序和同源比对等分析，鉴定为苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)，GenBank登录号为NR_074243.1。通过理化性质和降解特性分析发现，该菌株能以芘为唯一碳源进行生长繁殖，对芘具有良好的代谢能力。考虑到游离菌株在实际应用时易流失，且难以与土壤土著微生物竞争等问题，研发适合的固定化技术，是保证功能微生物能够高效降解污染物的关键。将功能菌株与固定化载体混合后，功能菌株可在固定化载体内部及表面附着生长，一方面能够降低外界环境对功能微生物的不利影响，另一方面固定化材料能够富集土壤中的污染物质，增大降解微生物与污染物之间的接触机率，从而提高污染物降解效率。高岭土是一种粘土矿物，具有良好的吸附性能与机械强度。细菌微生物表面的羧基、羟基、磷酸基等官能团，可与粘土矿物表面的硅基、羟基等活性位点发生质子化或去质子化反应，促使细菌微生物与粘土矿物进行特异性吸附，形成细菌微生物
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黏土矿物复合体。然而，常规高岭土表面性质和化学反应性较差，吸附能力较弱，难以与细菌微生物之间发生良好的特异性吸附。因此，本方法通过盐酸对高岭土进行表面改性后作为负载材料。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种芘降解功能菌株固定化方法，并用于联合修复多环芳烃污染土壤。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种改性高岭土固定化芘降解菌剂的制备方法，包括以下步骤：
[0006]步骤1)：在高岭土中缓慢加入盐酸溶液并加热搅拌反应，使用蒸馏水进行重悬洗脱并离心回收，重复洗脱和离心直至洗脱液呈中性为止，固体干燥后即得酸改性高岭土；
[0007]步骤2)：将筛选获得的芘降解功能菌株接种于LB液体培养基中，置于恒温摇床中振荡进行活化培养，所得菌液经离心机离心后，弃去上清液，收集底部菌体即得活化浓缩菌
液；
[0008]步骤3)：将步骤2)得到的活化浓缩菌液和步骤1)得到的酸改性高岭土依次加入到无菌LB液体培养基中，然后置于恒温摇床内振荡进行培养和结合反应；
[0009]步骤4)：培养结束后，经离心机离心处理后，弃去上清液，收集底部固体物进行冷冻干燥，获得粉末状固定化菌剂，置于冰箱内保存，即得改性高岭土固定化芘降解菌剂。
[0010]优选地，所述步骤1)中高岭土与盐酸溶液的比例为1g:(8～10)mL，盐酸浓度为3～5mol/L。
[0011]优选地，所述步骤1)中加热的温度为60～80℃，反应的时间为2～4h。
[0012]优选地，所述步骤2)中芘降解功能菌株为苍白杆菌，其能以芘为唯一碳源进行生长繁殖。本专利技术中的苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.25494，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2022年08月05日。
[0013]优选地，所述步骤2)中活化培养的温度为37℃，时间为1～2d；离心机的转速为3000～5000r/min，离心机的温度为4～6℃，离心时间为10～20min。
[0014]优选地，所述步骤3)中活化浓缩菌液、酸改性高岭土与无菌LB液体培养基的质量比为1:20～40:250。
[0015]优选地，所述步骤3)中恒温摇床的控制温度为37℃，振荡的速率为150～200r/min，时间为1～2d。
[0016]优选地，所述步骤4)中离心机的转速为4000～6000r/min，离心机温度为4～6℃，离心的时间为10～20min；冷冻干燥的时间为12～24h，冰箱的保存温度为
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20℃。
[0017]本专利技术还提供了上述制备方法制备的改性高岭土固定化芘降解菌剂。
[0018]本专利技术还提供了上述改性高岭土固定化芘降解菌剂在修复多环芳烃污染土壤中的应用。
[0019]优选地，将所述改性高岭土固定化芘降解菌剂与多环芳烃污染土壤以质量比2～3:100充分混合。
[0020]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0021](1)本专利技术所述方法将芘降解功能菌株固定在酸改性高岭土载体中，一方面酸改性高岭土可为芘降解功能菌株提供稳定的生长环境，降低外界环境对功能微生物的不利影响，另一方面可提高芘降解功能菌株的环境浓度，提高实际使用中的芘降解效率。此外，酸改性高岭土能够富集土壤中的污染物质，增大降解微生物与污染物之间的接触机率，从而提高污染物降解效率。
[0022](2)本专利技术利用盐酸对高岭土进行改性处理，提高了高岭土对于微生物的吸附结合能力，使得芘降解功能菌株可在固定化载体内部及表面牢固固定且生长良好，形成了细菌微生物
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粘土矿物复合体。将其应用于多环芳烃污染土壤修复中，可取得较好的修复效果，相比化学氧化和热处理等修复方法，具有反应温和、成本低廉、无二次污染等有益效果，具有广阔的工程化应用前景。高岭土本身是一种黏土矿物，对土壤环境不会产生危害影响，具有绿色、可持续等优点。
附图说明
[0023]图1为实施例1制备的酸改性高岭土的照片；
[0024]图2为实施例1制备的改性高岭土固定化芘降解菌剂的照片。
具体实施方式
[0025]为使本专利技术更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
[0026]本专利技术所使用的试剂均购于国药集团化学试剂(上海)有限公司。芘降解功能菌株为专利技术人从石油烃污染土壤中筛分获得的芘降解功能菌株苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.25494，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2022年08月05日。
[0027]实施例1
[0028]本实施例提供了一种改性高岭土固定化芘降解菌剂的制备方法，具体步骤如下：
[0029]步骤1：称取31.25g高纯度高岭土于烧杯中，缓慢加入250mL浓度为4mol/L本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种改性高岭土固定化芘降解菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)：在高岭土中缓慢加入盐酸溶液并加热搅拌反应，使用蒸馏水进行重悬洗脱并离心回收，重复洗脱和离心直至洗脱液呈中性为止，固体干燥后即得酸改性高岭土；步骤2)：将筛选获得的芘降解功能菌株接种于LB液体培养基中，置于恒温摇床中振荡进行活化培养，所得菌液经离心机离心后，弃去上清液，收集底部菌体即得活化浓缩菌液；步骤3)：将步骤2)得到的活化浓缩菌液和步骤1)得到的酸改性高岭土依次加入到无菌LB液体培养基中，然后置于恒温摇床内振荡进行培养和结合反应；步骤4)：培养结束后，经离心机离心处理后，弃去上清液，收集底部固体物进行冷冻干燥，获得粉末状固定化菌剂，置于冰箱内保存，即得改性高岭土固定化芘降解菌剂。2.如权利要求1所述的改性高岭土固定化芘降解菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中高岭土与盐酸溶液的比例为1g:(8～10)mL，盐酸浓度为3～5mol/L。3.如权利要求1所述的改性高岭土固定化芘降解菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中加热的温度为60～80℃，反应的时间为2～4h。4.如权利要求1所述的改性高岭土固定化芘降解菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中芘降解功能菌株为苍白杆菌，分类名Ochrobactrum sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.25494，保藏地址：北京市...

【专利技术属性】
技术研发人员：高品，唐正，孔一繁，张漓杉，钟山，潘云飞，
申请(专利权)人：桂林电子科技大学，
类型：发明
国别省市：