水稻铜胁迫响应基因OsCORK1及其编码蛋白与应用制造技术

本发明专利技术涉及水稻铜胁迫响应基因OsCORK1及其编码蛋白与应用。本发明专利技术通过构建CRISPR/Cas9

【技术实现步骤摘要】
水稻铜胁迫响应基因OsCORK1及其编码蛋白与应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及水稻铜胁迫响应基因OsCORK1及其编码蛋白与应用。

技术介绍

[0002]水稻是世界上仅次于玉米的第二大粮食作物，亦是我国的第一大粮食作物，全国约60％的人以大米为主食。然而，近年来随着经济社会的飞速发展和人民生活水平的提高，农业生产中的重金属污染已经成为不容回避且亟待解决的问题。重金属污染会严重影响植物的正常生长发育，导致稻米产量下降，品质降低。受重金属污染的稻米被人们食用后会导致重金属在身体内积累，长期食用会导致精神系统及免疫系统紊乱，严重威胁人们生命健康安全。
[0003]铜是植物生长发育所必须的微量元素，对植物的正常生长发育不可或缺，广泛参与植物体内的多种代谢反应，对于提高作物产量、改善作物品质都有重要意义。然而，过多的铜积累也严重抑制植物正常生长发育，特别是根系生长，极端情况下可造成植物死亡。因此，研究植物对重金属胁迫的应答，挖掘关键基因对治理重金属污染十分重要。类受体蛋白激酶(Receptor
‑
like kinase,RLK)是植物体内一类最大的基因家族，广泛参与植物生长发育的多个过程，如生物胁迫和非生物胁迫等。然而，关于植物RLK响应重金属胁迫信号，参与调控重金属污染的生物学功能却未见报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种水稻铜胁迫响应基因，OsCORK1基因。
[0005]本专利技术的第二个目的在于提供水稻铜胁迫响应蛋白，OsCORK1蛋白。
[0006]本专利技术的第三个目的在于提供上述OsCORK1基因的克隆引物。
[0007]本专利技术的第四个目的在于提供含有上述OsCORK1基因的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌。
[0008]本专利技术的第五个目的在于提供上述OsCORK1基因或OsCORK1蛋白的应用。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0010]水稻铜胁迫响应基因，所述基因为OsCORK1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0011]水稻铜胁迫响应蛋白，所述蛋白为OsCORK1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0012]本专利技术提供了水稻铜胁迫响应基因及其编码蛋白，该基因来源于水稻，命名为OsCORK1(Copper related Receptor
‑
like Kinase 1)，所编码的相应蛋白命名为OsCORK1。OsCORK1基因序列全长为1992bp，外显子CDS序列全长为1767bp，编码588个氨基酸。
[0013]克隆上述OsCORK1基因的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3
‑
4所示。
[0014]含有如权利要求1所述的OsCORK1基因的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌。
[0015]使用本专利技术所提供的OsCORK1基因构建重组表达载体导入入植物细胞，获得改善的水稻铜胁迫响应植株过程中，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种组成型启动子、增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物或转基因植物细胞进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行适当加工，如加入可选择性标记(GUS基因、GFP、YFP和荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记基因(抗潮霉素，抗除草剂Basta等基因)。为了转基因植物释放的安全性，在构建植物表达载体时也可不携带任何标记基因，在苗期进行特定PCR分子标记筛选。含有本专利技术OsCORK1基因的表达载体可通过显微注射、根癌农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
[0016]上述OsCORK1基因或OsCORK1蛋白的应用，为以下任一所示：
[0017]1)在提高水稻铜胁迫抗性中的应用；
[0018]2)在水稻铜胁迫抗性品种选育中的应用；
[0019]3)在降低水稻生产中的重金属污染方面的应用，所述重金属为铜。
[0020]优选的，通过对OsCORK1基因进行敲除，获得对铜胁迫抗性提高的植株。
[0021]优选的，通过CRISPR
‑
Cas9对OsCORK1基因进行敲除。
[0022]进一步优选的，还包括如下步骤：提取OsCORK1基因敲除突变体基因组DNA进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序鉴定基因突变类型；其中，所述PCR扩增的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5
‑
6所示。
[0023]本专利技术取得的有益效果：
[0024]本专利技术提供了水稻铜胁迫响应基因OsCORK1基因及其编码的蛋白，并进一步提供了OsCORK1基因或蛋白在提高水稻铜胁迫抗性或在水稻铜胁迫抗性品种选育中的应用。本专利技术通过构建CRISPR/Cas9
‑
OsCORK1敲除载体，利用农杆菌介导法转化水稻，获得OsCORK1敲除突变体；并通过试验证明敲除OsCORK1基因的水稻突变体经10μM CuSO4处理后，突变体的Cu积累量较野生型对照显著降低(P＜0.01)，可显著改善植株的耐铜性；且突变体地上长度、根长及鲜重较野生型长或大(P＜0.05)，表明降低OsCORK1基因的表达可显著增强水稻对铜胁迫的抗性。OsCORK1基因为水稻耐铜分子育种提供了优良的候选基因，在水稻抗逆育种及降低农业生产中的重金属污染方面具有良好的应用前景。
附图说明
[0025]图1为OsCORK1基因的克隆；
[0026]图2为OsCORK1编码蛋白的结构域预测；
[0027]图3为OsCORK1基因的表达模式分析；
[0028]图4为OsCORK1基因的CRISPR/Cas9靶标序列位点分析；
[0029]图5为Cas9
‑
OsCORK1敲除水稻突变体材料的测序分析；
[0030]图6为10μM Cu
2+
处理两周龄OsCORK1敲除水稻突变体和野生型对照Kitaake幼苗3d的铜含量分析；
[0031]图7为OsCORK1功能缺失突变体的铜胁迫抗性分析；
[0032]图中，A为WT与OsCORK1功能缺失突变体在10μm Cu
2+
处理后表型；B为WT与OsCORK1功能缺失突变体在10μm Cu
2+
处理后地上部长度比较；C为WT与OsCORK1功能缺失突变体在10μm Cu
2+
处理后主根长度比较；D为WT与OsCORK1功能缺失突变体在10μm Cu
2+
处理后鲜重比
较。
[0033]图8为Cas9
‑
OsCORK1敲除水稻突变体材料种OsCORK1基因表达量分析。
具体实施方式
[0034]下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步描述，但本专利技术的保本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.水稻铜胁迫响应基因，其特征在于，所述基因为OsCORK1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.水稻铜胁迫响应蛋白，其特征在于，所述蛋白为OsCORK1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.克隆如权利要求1所述的OsCORK1基因的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3
‑
4所示。4.含有如权利要求1所述的OsCORK1基因的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌。5.如权利要求1所述的OsCORK1基因或如权利要求2所述的OsCORK1蛋白的应用，为以下任一所示：1)在提高水稻...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜长青，李珅，赵全志，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：