一种未灭菌条件构建产乳酸-乙酸微生物菌群方法技术

本发明专利技术属于微生物技术领域，公开了一种未灭菌条件构建产乳酸

【技术实现步骤摘要】
一种未灭菌条件构建产乳酸
‑
乙酸微生物菌群方法


[0001]本专利技术涉及微生物
，具体为一种未灭菌条件构建产乳酸
‑
乙酸微生物菌群方法。

技术介绍

[0002]我国是农业大国，粮食产量和农业副产品产量位居世界前列，但对农业废弃物处理还有待进一步发展。我国每年有大量未被利用的作物秸秆，不但是生物质能源的浪费，还会对环境造成压力。基于厌氧发酵技术，能够将秸秆等农业废弃物转化为沼气和中链脂肪酸等产品。转化上述产品的过程中，乳酸和乙酸都是重要的前体物质。沼气生成过程中，乳酸相较于乙酸难降解、转化效率低，增加发酵过程中乙酸含量，能够缩短产气进程，提高产气效率。对于中链脂肪酸的生产过程，乳酸和乙酸是碳链延长过程中的重要的电子供体和电子受体，提高体系中的乙酸含量能够在不添加外源电子受体的情况下实现中链脂肪酸的生产。因此，调控水解酸化体系高效协同产酸对于提高中链脂肪酸和沼气产量都具有重要意义。但是，目前依靠微生物技术协同产乳酸和乙酸，特别是提高乙酸含量的技术匮乏。
[0003]目前专注于提高单一乳酸含量的研究较多。张文娟在短期分批发酵模式下，通过调控不同参数，在最优发酵温度35℃、pH9条件下，得到最高乳酸产率0.67 g COD/g TCOD。现有的提高体系中乙酸含量的研究大多集中于青贮秸秆。何慧英将协同产乳酸、乙酸效果较好的菌株Lb. farciminis 1101和Lb. brevis 0991应用于玉米秸秆发酵，发酵液中乳酸含量分别为>150mM、0.203mol/L，乙酸含量均为38mM。但是，对于从菌群构建角度构建协同产酸菌群的技术研究的关注程度有限。
[0004]单一菌种添加到水解酸化体系中会出现产酸效率低，酶组分不全的问题。利用多菌种之间互利共营、功能互补的协同作用，提高发酵酶的产率且酶系比例协调，能够提升体系产酸效率。但是无论是单菌种组配的菌系还是从酸性体系中筛选出的菌群等，其筛选及培养环境均依赖无菌环境，即在无菌环境中传代稳定，只要体系灭菌，就有较高的产酸效率。但在实际应用过程中，灭菌条件培养的菌群恰恰限制了实际应用中使用秸秆、牛粪原料，产酸强化效果不明显，相关研究已被证实在连续迭代的过程中，无菌环境筛选的产酸菌群很容易被外界复杂环境土著菌群所替代，导致添加的强化菌群无法成为体系的优势菌群。在全程未灭菌条件中构建成功的菌系具有的抗逆性要远高于灭菌培养条件下的菌系，由于其复杂的生长繁殖环境，在将菌群接种到水解酸化体系中后，能够很快适应环境，菌系存活率、繁殖效果远好于灭菌培养条件构件的菌群。营造适当的无菌环境进行筛选目标菌群，也是本专利解决的重点问题之一。
[0005]目前的方法仅限于自然条件筛选或高效产酸菌间的组配，但对于自然条件筛选来说，菌源单一、培养环境简单，对于高效产酸菌的组配来说，具有乙酸和乳酸功能的菌在一起组配的几乎没有报道，而且协同产乳酸、乙酸菌的组配未见报道。本专利思路为在全程不灭菌的基础上，多菌源、多轮次、多组合、注重乙酸乳酸协同、多种培养环境的长期筛选组配，在发酵环境进一步巩固驯化，最终得到产乙酸、乳酸协同性高、产量高、稳定性高的菌
群，适合处理含纤维类物料，菌群兼备高效分解木质纤维素的能力。
[0006]基于上述分析说明，本专利创新性提出多原料协同、多措并举、精筛融合的正向和反向菌群构建手段，以廉价易得菌源在未灭菌条件下凭借自然选择和功能诱导限制性迭代培养构建协同产酸菌群和在未灭菌条件下以已知高产菌种复配构建协同产酸菌群的方法，进而提升秸秆厌氧发酵体系协同高效产乳酸和乙酸能力，并增强后续应用的效果和稳定性。

技术实现思路

[0007]本专利技术意在提供一种未灭菌条件构建产乳酸
‑
乙酸微生物菌群方法，采用正向构建和反向构建两种技术路线，正向构建通过限制性迭代培养的到高效产酸复合菌系，反向构建是将高产菌株进行组配得到组配菌系，然后将其组配得到菌群，以解决微生物协同产酸技术的缺乏。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种未灭菌条件构建产乳酸
‑
乙酸微生物菌群方法，包括以下步骤：S1、正向构建菌群：S1.1选择深度为5、25、45、65、85cm且有机质含量达到40
×
10
‑3的酸性土壤或常温下微好氧发酵24h~72h后有明显酸味的东北泡菜或品质优良的黄贮秸秆中任一一种含有乳酸菌的丰富菌群作为原菌源，在未灭菌条件下将原菌源在30℃~37℃接种至改良的选择性培养基中进行恒温静置培养；S1.2以体积分数比为10%~20%的接种比进行接种，传代培养10~30代，初始培养菌群生长速度较慢，第1
‑
4代培养时间为72h；自第5代开始，菌群适应培养基环境且处于活跃状态，第5~30代的培养时间为36h；筛选出pH在10代以内迅速下降到4.5及以下的、处于对数期生长的菌群即培养基混浊未分层、菌群组成稳定的三种复合菌系：
①
单产乳酸产量大于等于5g/L且乳酸占总挥发酸30%及以上的复杂菌系Z1、
②
单产乙酸产量大于等于1.5g/L且乙酸占总挥发酸35%及以上的复杂菌系Z2、
③
乳酸和乙酸协同生产总产量大于等于6.5g/L且乳酸和乙酸占总挥发酸的50%及以上复杂菌系Z3；连续5代以上满足限定条件的即为驯化培养成功；S1.3取S1.2筛选出的复杂菌系离心去掉上清液，用生理盐水重悬将菌液浓度统一调为10
10 cfu/mL；S2、反向构建菌群：S2.1将同型产乳酸菌：德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌，异型产乳酸菌：短乳杆菌、布氏乳杆菌分别接种在优化的MRS培养基上进行活化培养24h~72h，活化培养好的复合菌系命名为F1、F2、F3、F4；其中，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种来自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为ACCC 05468；所述嗜酸乳杆菌来自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为ACCC 19887；所述短乳杆菌来自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为ACCC 05488，所述布氏乳杆菌来自中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC 1.15607；S2.2取S2.1活化培养后的复合菌液离心去掉上清液，用生理盐水重悬将菌液浓度统一调为10
10 cfu/mL；
S3、菌群的组配：S3.1不同目标产物下的组配：S3.1.1以乳酸为目标产物的组配，选取S1.2中的Z1与S2.1中的F1或F2进行组配：Z1+F1、Z1+F2；S3.1.2以乙酸为目标产物的组配，选取S1.2中的Z2与S2.1中的F3或F4进行组配：Z2+F3、Z2+F4；S3.1.3以乳酸、乙酸为目标产物的组配：选取S1.2中的Z1、Z2和Z3与S2.1中的F1、F2、F3和F4中的两种进行组配：Z1+Z2、Z1+Z3、Z1+F3、Z1+ F4、Z2+Z3、Z2+ F3、Z2+ F4、Z3+ F1、Z3+ F2、Z3+ F3、Z3+ F4、F1+F3、F1+F4、F2+F3、F本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种未灭菌条件构建产乳酸
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乙酸微生物菌群方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、正向构建菌群：S1.1选择深度为5、25、45、65、85cm且有机质含量达到40
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10
‑3的酸性土壤或常温下微好氧发酵24h~72h后有明显酸味的东北泡菜或品质优良的黄贮秸秆中的任一一种含有乳酸菌的丰富菌群作为原菌源，未灭菌条件下将原菌源在30℃~37℃下接种至改良的选择性培养基中进行恒温静置培养；S1.2以体积分数比为10%~20%的接种比进行接种，传代培养10~30代，初始培养菌群生长速度较慢，第1~4代培养时间为72h；自第5代开始，菌群适应培养基环境且处于活跃状态，第5~30代的培养时间为36h；筛选出pH在10代以内迅速下降到4.5及以下的、处于对数期生长的菌群即培养基混浊未分层、菌群组成稳定的三种复合菌系：
①
单产乳酸产量大于等于5g/L且乳酸占总挥发酸30%及以上的复杂菌系Z1、
②
单产乙酸产量大于等于1.5g/L且乙酸占总挥发酸35%及以上的复杂菌系Z2、
③
乳酸和乙酸协同生产总产量大于等于6.5g/L且乳酸和乙酸占总挥发酸的50%及以上复杂菌系Z3；连续5代以上满足限定条件的即为驯化培养成功；S1.3取S1.2筛选出的复杂菌系离心去掉上清液，用生理盐水重悬将菌液浓度统一调为10
10 cfu/mL；S2、反向构建菌群：S2.1将同型产乳酸菌：德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌，异型产乳酸菌：短乳杆菌、布氏乳杆菌分别接种在优化的MRS培养基上进行活化培养24h~72h，活化培养好的复合菌系命名为F1、F2、F3、F4；其中，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种来自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为ACCC 05468；所述嗜酸乳杆菌来自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为ACCC 19887；所述短乳杆菌来自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为ACCC 05488，所述布氏乳杆菌来自中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC 1.15607；S2.2取S2.1活化培养后的复合菌液离心去掉上清液，用生理盐水重悬将菌液浓度统一调为10
10 cfu/mL；S3、菌群的组配：S3.1不同目标产物下的组配：S3.1.1以乳酸为目标产物的组配，选取S1.2中的Z1与S2.1中的F1或F2进行组配：Z1+F1、Z1+F2；S3.1.2以乙酸为目标产物的组配，选取S1.2中的Z2与S2.1中的F3或F4进行组配：Z2+F3、Z2+F4；S3.1.3以乳酸、乙...

【专利技术属性】
技术研发人员：于佳动，赵立欣，黄越，姚宗路，罗娟，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所，
类型：发明
国别省市：