一种获得无病毒细胞系的方法及其所获得的无病毒细胞系技术

本发明专利技术公开了一种从病毒污染的生物体或细胞群体中建立无病毒细胞系的方法，还提供了根据上述方法建立的源自病毒污染的生物体或细胞群体的无病毒细胞系。示例性建立无病毒细胞系的方法包括从病毒污染的生物体或细胞群体中获得细胞，清洗并重悬后分离成单个细胞或多个细胞，将分离所得到的单个细胞或多个细胞在包含利巴韦林的细胞培养基中培养扩增并形成单细胞克隆或多细胞克隆，检测所述细胞克隆或细胞培养基中是否存在病毒，将检测病毒不存在的细胞克隆接种于不含有利巴韦林的细胞培养基中继续培养扩增，从而获得无病毒细胞系。从而获得无病毒细胞系。

【技术实现步骤摘要】
一种获得无病毒细胞系的方法及其所获得的无病毒细胞系


[0001]本专利技术涉及用于获得无病毒细胞系的方法，以及应用所述方法获得的无病毒细胞系，所述无病毒细胞系源自被病毒污染的生物体或细胞群体。

技术介绍

[0002]昆虫细胞广泛用于重组蛋白的表达，通常用作重组杆状病毒载体的宿主，也可用于质粒介导的瞬时转染或稳定的遗传转化。昆虫细胞可用于科研表达蛋白质，以及制造人用生物制品和兽医生物制品。杆状病毒
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昆虫表达系统(BICS)是一类应用广泛的真核表达系统，是以杆状病毒为外源基因载体，昆虫细胞为受体的表达系统，具有安全、高效、容量大、表达量高、表达产物能够进行折叠和修饰等特点，已被生物医药领域广泛应用。最近发现几种用于重组蛋白表达的昆虫细胞系被持续感染外源病毒，这就对这些感染可能如何影响使用这些细胞系进行的研究提出了疑问。此外，这些发现引起了人们对使用这些细胞系生产的生物制品的安全性的密切关注。
[0003]Sf
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弹状病毒(Sf
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Rhabdovirus)是在同一时间由三个不同团队在不同的Sf(Spodoptera frugiperda)细胞系中独立发现的。Sf
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弹状病毒是一种典型的弹状病毒，其单(
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)链基因组的大小接近13.5kb，依次编码典型的弹状病毒核蛋白(N)，磷蛋白(P)，基质(M)，糖蛋白(G)和RNA依赖的RNA聚合酶(L)。G和L之间，有一个额外的可读框，命名为“X”并编码一种假定的病毒孢子素，感染的Sf细胞连续传代后，X基因可能丢失，而Sf
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弹状病毒的体外感染不需要该基因。
[0004]新的不含外源病毒的昆虫细胞系已被分离出来作为改进的研究工具和更安全的生物制造平台使用。为了完全去除Sf9(Spodoptera frugiperda 9)细胞中的Sf
‑
弹状病毒，格里科贝克公司采用核苷类药物处理由若干个细胞组成的起始培养物，进一步扩增培养获得了无Sf
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弹状病毒的细胞系，其最终使用的药物为6
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氮杂尿苷(专利申请号CN201680071306.3)。但该专利申请在实际筛选中尝试了施用多种药物共同抑制的方法，施用多种抗病毒药物会影响细胞代谢及生物合成过程，加重细胞损伤，影响筛选后细胞重组及表达病毒的能力。虽然另有其它的研究在不加入抗病毒药物的情况下通过筛选获得了生长特性相似，活力更优的细胞系(专利申请号CN201910317758.0)，但由该种方法获得无病毒细胞系的效率很低。
[0005]因此，对于能够有效和稳定地从病毒污染的生物体或细胞群体中获得并建立无病毒细胞系的方法，以及不含污染病毒的细胞系，且该细胞系能够保持其原有的细胞生物学特性及功能，例如，细胞活率和表达外源重组蛋白或产生重组病毒的能力等，在本领域仍然存在需求。

技术实现思路

[0006]本专利技术是基于专利技术人的如下发现：从病毒污染的生物体或细胞群体中建立无病毒细胞系时，所使用的抗病毒药物种类及其浓度、起始培养时的细胞数量对于建立无病毒细
胞系的效率以及所建立的细胞系能否保持其细胞生物学特性和功能是至关重要的。
[0007]因此，本专利技术提供了一种能有效和稳定地从被病毒污染的生物体或细胞群体中建立无病毒细胞系的方法，以及应用该方法建立的细胞系，其中所述细胞系在缺乏病毒的同时仍能保持相关的细胞生物学特性及功能(例如细胞活率、产生重组病毒或表达重组蛋白的能力等)。
[0008]本专利技术一方面提供了一种从病毒污染的生物体或细胞群体中获得和建立无病毒细胞系的方法，包括如下步骤：从病毒污染的生物体或细胞群体中获得细胞，清洗并重悬上述细胞后，将其分离成单个细胞或多个细胞，将上述单个细胞或多个细胞置于含有一定浓度利巴韦林的细胞培养基中培养一段时间，形成单细胞克隆或多细胞克隆。从上述细胞克隆中取出部分细胞及上清培养基，检测病毒是否存在，将检测病毒不存在的细胞克隆接种于不含有利巴韦林的培养基中继续培养扩增，获得无病毒细胞系。
[0009]在另一方面，本专利技术中所述的污染生物体或细胞群体的病毒是Sf
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弹状病毒。在另一方面，本专利技术中所述的病毒污染的生物体是昆虫，优选草地贪夜蛾；病毒污染的细胞群体是已建立的细胞系或细胞株，例如商购或市售的细胞系，优选昆虫细胞系，更优选Sf细胞系(例如Sf9细胞系，Sf21细胞系等)。
[0010]因此，本专利技术的所述细胞系可以直接或间接来源于草地贪夜蛾，或者可以来源于商购或市售的Sf9细胞系(在本专利技术中可以用SF
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Rha表示，意为含有Sf
‑
弹状病毒的Sf9细胞系)。
[0011]进一步地，本专利技术在另一方面提供了一种无病毒的Sf细胞系(在本专利技术中称之为SF
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RVN细胞系)，所述细胞系来源于商购或市售的Sf9细胞系，并由以上方法建立。与含有Sf
‑
弹状病毒的原始Sf9细胞系相比，本专利技术建立的细胞系缺乏Sf
‑
弹状病毒，并且具有与原始Sf9细胞相同或基本相同的细胞活率、细胞直径、细胞结团率及细胞倍增时间，并且与Sf9细胞具有相同或基本相同，甚至更优的杆状病毒传代稳定性和重组AAV产量。
[0012]下面结合附图和具体实施方式对本专利技术做进一步说明，并非对本专利技术的限制。凡是依照本专利申请公开内容所进行的任何等同替换，均属于本专利的保护范围。
附图说明
[0013]图1.细胞活率比较，其中SF
‑
RVN表示筛选出的无Sf
‑
弹状病毒的Sf9细胞，SF
‑
Rha表示有Sf
‑
弹状病毒污染的Sf9细胞。
[0014]图2.细胞直径比较，其中SF
‑
RVN表示筛选出的无Sf
‑
弹状病毒的Sf9细胞，SF
‑
Rha表示有Sf
‑
弹状病毒污染的Sf9细胞。
[0015]图3.细胞结团率比较，其中SF
‑
RVN表示筛选出的无Sf
‑
弹状病毒的Sf9细胞，SF
‑
Rha表示有Sf
‑
弹状病毒污染的Sf9细胞。
[0016]图4.细胞倍增时间比较，其中SF
‑
RVN表示筛选出的无Sf
‑
弹状病毒的Sf9细胞，SF
‑
Rha表示有Sf
‑
弹状病毒污染的Sf9细胞。
[0017]图5.杆状病毒的传代稳定性(目标基因组滴度与杆状病毒基因组滴度的比值)比较，其中SF
‑
RVN表示筛选出的无Sf
‑
弹状病毒的Sf9细胞，SF
‑
Rha表示有Sf
‑
弹状病毒污染的Sf9细胞。
[0018]图6.重组AAV病毒产量比较，其中SF
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从源自病毒污染的生物体或细胞群体中建立无病毒细胞系的方法，包括：从病毒污染的生物体或细胞群体中获得细胞，清洗并重悬后分离成单个细胞或多个细胞；将分离得到的单个细胞或多个细胞在包含利巴韦林的细胞培养基中培养扩增，并形成单细胞克隆或多细胞克隆；取出所述细胞克隆或所述细胞培养基的一部分以检测病毒是否存在；将检测病毒不存在的细胞克隆接种于不含有利巴韦林的细胞培养基中继续培养扩增，从而获得无病毒细胞系。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒包括Sf
‑
弹状病毒。3.根据权利要求1或2中所述的方法，其中所述生物体是昆虫，所述细胞群体是昆虫细胞系。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述昆虫包括鳞翅目昆虫。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述鳞翅目昆虫包括草地贪夜蛾、粉纹夜蛾或家蚕。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞系源自病毒污染的原代细胞。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞系源自病毒污染的Sf细胞系。8.根据权利要求1
‑
7中任一项所述的方法，其中所述病毒污染的Sf细胞系包括Sf21细胞或Sf9细胞，并且其中所述病毒包括Sf
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弹状病毒。9.根据权利要求1
‑
8中任一项所述的方法，其中所述检测方法包括：(a)RT
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PCR；(b)RT
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PCR和巢式PCR；(c)定量RT
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PCR；或(d)基于抗体的检测技术。10.根据权利要求1
‑
9中任一项所述的方法，其中分离成单个细胞或多个细胞的方法包括：有限稀释克隆、在软琼脂中克隆细胞并随后挑取细胞集落、细胞分选、激光捕获显微切割(LCM)、使用微量移液管手动捕获、微流体或使用显微操作器，优选为有限稀释克隆。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述多个细胞为2
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20个细胞，优选3
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨慧，李莉莉，
申请(专利权)人：北京三诺佳邑生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：