一种改善免疫抑制微环境的胰腺癌靶向外泌体疫苗制造技术

本发明专利技术属生物技术领域，具体涉及一种改善免疫抑制微环境的胰腺癌靶向的外泌体疫苗。本发明专利技术中将免疫激活多肽和基因药物负载于同一肿瘤外泌体中，构建肿瘤靶向药物递送系统，制得外泌体疫苗。所述外泌体疫苗能激活肿瘤部位免疫反应，解除免疫抑制微环境，达到预防和抑制肿瘤生长的目的；同时，所述外泌体疫苗联用胰腺癌一线化疗药物，能增强胰腺癌治疗效果，实现肿瘤抑制和个体生存期延长的目的。实现肿瘤抑制和个体生存期延长的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种改善免疫抑制微环境的胰腺癌靶向外泌体疫苗


[0001]本专利技术属生物
，具体涉及一种改善免疫抑制微环境的胰腺癌靶向外泌体疫苗及其制备方法。

技术介绍

[0002]据报道，胰腺导管腺癌(PDAC)是目前较凶险的癌症之一，其主要特点为早期诊断难、化疗耐药率高，大多患者在确诊时已为肿瘤晚期阶段或发生肿瘤转移，难以实现手术切除，患者五年生存率不足6％。由于常规治疗获益有限，治标不治本，因此迫切需要寻找新的治疗措施以延长患者的生存率。
[0003]近来，PD
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1、PD
‑
L1、CTLA
‑
4抗体等药物在白血病、黑色素瘤中取得巨大突破，免疫疗法，包括肿瘤疫苗、免疫检查点抑制剂、过继性细胞治疗(例如CAR
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T)等成为了大众关注的焦点。与其他干预治疗方式相比，免疫疗法通过增强人体本身的免疫反应，以达到抑制肿瘤生长的目的。虽然在实体瘤中取得了一定的疗效，由于丰富的PDAC肿瘤基质、高间质压力、低血管增生、低血流灌注，免疫疗法在治疗PDAC患者中少有成功案例。此外，PDAC肿瘤形成过程中伴随着大量免疫抑制性白细胞的浸润，逐渐构成肿瘤免疫抑制微环境，为免疫疗法提供障碍。另外，干预治疗有关肿瘤的难点在于PDAC肿瘤环境中抑制肿瘤生长的细胞毒性T淋巴细胞数量不足，因此，招募更多的抗肿瘤活性的免疫细胞、改善PDAC肿瘤免疫抑制微环境迫在眉睫。
[0004]有研究公开了纳米疫苗在免疫治疗中广泛应用于快速诱导强大的靶向免疫应答。肿瘤疫苗接种的关键点在于树突状细胞(DC细胞)，作为主要的抗原提呈细胞，DC细胞可捕获和呈递肿瘤抗原，表达共刺激分子并分泌细胞因子以激活适应性和先天性免疫应答，使其成为癌症免疫疗法的理想候选者。然而，研究表明，免疫抑制细胞Tregs表面受体如CCR4、CCR8等可与DC分泌的趋化因子CCL17、CCL22作用，也即DC可通过CCR4/CCL22通路募集Treg细胞至肿瘤部位，诱导免疫抑制。因此，在降低DC诱导免疫抑制的同时获得增强的肿瘤免疫抑制效果仍是本领域中的一个挑战。
[0005]基于现有技术的现状，本申请的专利技术人拟提供一种改善免疫抑制微环境的胰腺癌靶向外泌体疫苗及其制备方法。

技术实现思路

[0006]为解决上述问题，本专利技术的目的在于提供一种改善免疫抑制微环境的胰腺癌靶向外泌体疫苗及其制备方法。
[0007]具体的，本专利技术提供一种将处于免疫原性凋亡状态的胰腺肿瘤细胞分泌的外泌体转化为多功能胰腺癌疫苗及其方法。
[0008]本专利技术的胰腺癌靶向外泌体疫苗由三个部分组成：抗原、佐剂和药物递送系统。
[0009]本专利技术中，外泌体来源于胰腺癌细胞PANC
‑
02，与肿瘤细胞表达相同的蛋白，自身即可成为免疫抗原。
[0010]本专利技术中，经低剂量米托蒽醌(MTX)处理后，PANC
‑
02细胞分泌的外泌体高表达免疫刺激信号(如钙网蛋白及高迁移率族蛋白B1)，经注射后可激活体内DC细胞，增强免疫。本专利技术中外泌体作为新型的药物载体，可进一步通过电转包载基因药物CCL22 siRNA，用于阻断CCR4/CCL22通路，以减少肿瘤部位免疫抑制性细胞的募集。为促进所述疫苗疗效，本专利技术中外泌体表面修饰MART
‑
1肽(序列：ELAGIGILTV，其具有免疫原性，可促进特异性抗肿瘤免疫反应)以激活肿瘤部位T淋巴细胞；由于与肿瘤同源，该外泌体疫苗spMEXO经肌肉注射后，能实现PDAC微环境靶向，激活特异性抗肿瘤反应，同时改善肿瘤免疫抑制微环境，发挥抗肿瘤疗效。
[0011]本专利技术中，提供了一种装载多肽及基因药物的外泌体递送系统，其包括外泌体、多肽及基因药物，所述纳米疫苗粒径约为100～120纳米。
[0012]本专利技术中，所用药物递送材料为经米托蒽醌处理后的PANC
‑
02胰腺癌细胞来源外泌体。
[0013]本专利技术中，所述多肽药物为一段免疫激活肽MART1
‑
CP05(命名为CM多肽，序列：ELAGIGILTV
‑
CRHSQMTVTSRL)，通过CP05与外泌体表面蛋白CD63结合，实现载药。
[0014]本专利技术中，所述基因药物为CCL22 siRNA
[0015](5
’‑
GCGUGGUGUUGCUAACCUUTT
‑3’
)，～109外泌体通过电转基因载药量为0.502
±
0.038μg。
[0016]本专利技术中，所述外泌体肿瘤疫苗可高效靶向肿瘤部位。
[0017]本专利技术中，所述肿瘤疫苗可显著延缓肿瘤生长。
[0018]本专利技术中，所述肿瘤疫苗抑制肿瘤生长的机理为：一是通过MART
‑
1多肽激活细胞毒性T细胞，促进肿瘤部位免疫应答；二是通过CCL22 siRNA阻断树突状细胞DC与免疫抑制性调节性T细胞Treg之间的CCR4/CCL22信号通路，减少肿瘤部位Treg的募集，改善免疫抑制微环境。
[0019]本专利技术中，所述肿瘤疫苗联用一线化疗药物吉西他滨和白蛋白紫杉醇可显著抑制肿瘤生长。
[0020]本专利技术中，所述肿瘤疫苗没有明显的系统毒性。
[0021]更具体的，
[0022]第一方面，本专利技术提供了一种外泌体提取、纯化的方法，包括以下步骤：
[0023](1)用含10μM米托蒽醌的DMEM完全培养基培养胰腺癌PANC
‑
02细胞系12小时。
[0024](2)收集的细胞培养上清前处理操作如下：800g离心5
‑
10分钟；2000g离心20分钟；15000g离心30分钟，0.22μm滤膜过滤。
[0025](3)随后上清进行超速离心处理提取外泌体，步骤如下：150000g离心2小时，4℃。
[0026](4)进一步使用含碘克沙醇的蔗糖梯度液纯化外泌体：将500μL步骤(3)中用PBS 7.4重悬的外泌体加入到蔗糖梯度液(5
‑
40％碘克沙醇，0.25mM蔗糖溶液，pH 7.4)中,100000g离心16小时，4℃；取第6、7毫升液体，150000g离心2小时，用PBS 7.4重悬，得到纯化后的外泌体MEXO。
[0027]第二方面，本专利技术提供了一种外泌体装载siRNA的方法，包括以下步骤：
[0028](1)通过超速离心将109外泌体重悬液替换为电转缓冲液(1.15mM磷酸钾pH 7.2，25mM氯化钾，21％碘克沙醇)。
[0029](2)向上述电转缓冲液中加入1μg CCL22 siRNA。
[0030](3)电转：400V,125μF，∞Ω。
[0031](4)通过超速离心除去游离siRNA并用PBS 7.4重悬，得到载siRNA的外泌体sMEXO。
[0032]第三方面，本专利技术提供了一种外泌体装载多肽的方法，包括以下步骤：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种改善免疫抑制微环境的胰腺癌靶向外泌体疫苗，其特征在于，由免疫激活多肽、基因药物siRNA和胰腺癌肿瘤细胞外泌体组成；所述的外泌体疫苗为多肽与基因药物共载药的肿瘤纳米疫苗；其中，所述纳米疫苗粒径为100纳米。2.按权利要求1所述的改善免疫抑制微环境的胰腺癌靶向外泌体疫苗，其特征在于，所述的装载多肽及siRNA的纳米疫苗，其中的外泌体为经10μM米托蒽醌处理后的PANC
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02胰腺癌细胞来源的外泌体。3.按权利要求1所述的改善免疫抑制微环境的胰腺癌靶向外泌体疫苗，其特征在于，所述的装载多肽及siRNA的纳米疫苗，其中多肽药物为一段免疫激活肽MART
‑
1，其序列：ELAGIGILTV，通过连接CP05肽，其序列：CRHSQMTVTSRL，与外泌体表面蛋白CD63结合，实现载药。4.按权利要求1所述的改善免疫抑制微环境的胰腺癌靶向外泌体疫苗，其特征在于，所述的装载多肽及siRNA的纳米疫苗，其中，所述基因药物为CCL22siRNA，其序列：5
’‑
G...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋晨，周文茜，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：