一种检测尿液中Calcitroicacid的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及体外诊断技术领域，具体涉及一种检测尿液中Calcitroic acid的方法及其应用。所述的检测方法包括：待测样本预处理；样本处理；绘制校准曲线：结果分析。本发明专利技术提供的优点：填补了Calcitroic acid定量方法的空白。检测时间短，具有特异性高、高通量、灵敏度高、抗干扰能力强、重现性好。试剂廉价易得；方法简单，利于推广。为Calcitroic acid在尿液中产生的机理研究奠定了方法学上的基础，并且为不同疾病模型当中生物标志物的研究提供了可靠的技术支撑。技术支撑。技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种检测尿液中Calcitroic acid的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及体外诊断
，具体涉及一种检测尿液中Calcitroic acid的方法及其应用。

技术介绍

[0002]维生素D是一种非常古老、高度保守的分子，出现在7.5亿年前。最初由简单生物的质膜组分开始逐渐演化至今，其功能已经发生巨大变化。维生素D主要与维生素D受体(VDR)结合发挥一系列生理作用。VDR广泛存在于机体各组织中，其多效性作用也被逐渐发现，在骨骼、肌肉、肿瘤、免疫、心血管、代谢、认知、衰老等各领域均发挥重要作用。
[0003]维生素D的研究始于上世纪初，当时斯汀伯克(Steenbock)观察到，经过辐射的食物具有抗佝偻病的特性，这在佝偻病困扰的工业时代是一个革命性的发现，尽管维生素D分子很快被分离出来，但科学家们花了40年时间才明白，在维生素D的代谢过程中产生的具有生物活性的维生素D类似物才是至关重要的。来自膳食或皮肤合成的维生素D不具有生物活性，需要由酶催化成有活性的代谢产物。维生素D在肝脏中被酶催化成25
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羟基维生素D(25(OH)D)，然后在肾脏中被催化成1,25
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二羟维生素D(1,25D)，被发现是所有类似物中最具有生物活性的，在维持机体各器官功能中起重要作用。
[0004]精确评估体内的1,25D水平对准确评估机体维生素D状态、机体各脏器功能、指导维生素D系统相关药物治疗、评估预后等具有重要作用。但临床上1,25D的检测存在较大困难：其水平极低(pg/ml级别)，检测难度大；本身为中间代谢产物，半衰期短，性质不稳定，对样本的收集要求严格，且容易造成检测误差；传统检测方法(如放射免疫法)误差大等，因此临床上无法常规进行1,25D的检测。更多的医疗机构退而求其次，仅检测25(OH)D用以代替1,25D的检测。但25(OH)D的检测仍存在系列弊端：25(OH)D需要在肾脏中被1α羟化酶羟化成具有生物活性的1,25
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二羟维生素D，仅检测25(OH)D不能代表衰老、肾功能减退等生理、病理状态下的1,25D水平，且传统的25(OH)D检测方法亦存在较大误差。
[0005]Calcitroic acid化学名：1a
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hydroxy
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23
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carboxy
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24,25,26,27
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tetranorvitamin D3，中文名：1a
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羟基
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23
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羧基
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24,25,26,27
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四脱维生素D3。其结构式如下：
[0006][0007]Calcitroic acid是三十余年前发现的1,25D的终末代谢产物，这个失活过程涉及到C(24)和C(23)原子上的一系列的氧化反应导致了侧链裂解，最终形成了Calcitroic acid。Calcitroic acid能够反映机体1,25D的真实水平，且其本身亦具有一定生物学功能；且该物质性质稳定，对样本的送检要求低。
[0008]到目前为止，还未有针对Calcitroic acid物质的定量方法，它在人体液中的浓度也并未见报道。与同传统的免疫学相比，液相色谱
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质谱联用技术(LC
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MS/MS)具有线性动态范围宽、通用性强、准确度高、多组分分析等优点，并且随着更多尖端技术的出现，使得LC
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MS/MS灵敏度得到了显著提高，LC
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MS/MS已逐渐成为内源性化合物研究必不可少的手段之一。但目前尚无利用LC
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MS/MS对于Calcitroic acid定量方法。它在人体液中的浓度也未见报道。Calcitroic acid在尿液中产生的机理亦尚未见报道。
[0009]目前并未有针对Calcitroic acid的检测方法。其原因可能有：
[0010]A.Calcitroic acid在人体中的生理浓度可能非常低。
[0011]B.虽然Calcitroic acid与1α,25
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二羟基维生素D3的结构十分类似，但所有适用于1α,25
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二羟基维生素D3的检测方法，均提升不了Calcitroic acid物质的灵敏度。
[0012]C.该物质在真实样本中检测波动较大，无法保证检测结果的稳定性。
[0013]D.市场上缺乏Calcitroic acid的同位素内标，无法对检测结果进行更好的校正。

技术实现思路

[0014]针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种检测时间短，具有特异性高、高通量、灵敏度高、抗干扰能力强、重现性好的一种检测尿液中Calcitroic acid的方法及其应用。
[0015]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0016]一种检测尿液中Calcitroic acid的方法，其特征在于，所述的检测方法包括：
[0017]S101待测样本：
[0018]新鲜采集的人尿液样本；
[0019]S102样本处理：
[0020]S201，室温条件下，分别移取相同体积的系列浓度的标准品溶液、S101所述的待测样本，分别加入内标溶液和方法稳定剂，充分混匀；
[0021]S202，往步骤S201处理后的所有样品中分别加入乙腈或甲醇溶液进行蛋白沉淀；
[0022]S203，往步骤S202处理后的所有样品中分别加入0.5％～5％的甲酸
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水溶液进行稀释后离心；
[0023]S204，将步骤S203处理后的所有样品上清液通过活化的固相萃取板进行萃取分离并洗脱，氮吹至干；
[0024]S205，往所有氮吹干后的样品加入甲醇
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水溶液复溶；
[0025]S206，取复溶的样品上清液进行液相色谱
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串联质谱分析；
[0026]S103绘制校准曲线：
[0027]通过各标准品标示浓度X，系列标准品与内标的峰面积比值Y，绘制校准曲线并拟合校准曲线方程；
[0028]S104结果分析：
[0029]分别将待检测人尿液样本中Calcitroic acid与内标峰面积比值代入校准曲线方程，计算待检测样本人尿液样本中Calcitroic acid的浓度。
[0030]进一步的，所述的标准品溶液为一组含有不同浓度Calcitroic acid标准品的人尿液溶液，按浓度大小依次设置，数量为至少6个，浓度为5～1000pg/mL；
[0031]所述的质控品为一组含有不同浓度Calcitroic acid标准品的人尿液溶液，按浓度大小依次设置，数量为至少3个，分别为低浓度质控品、中浓度质控品和高浓度质控品。
[0032]进一步的，所述的内标溶液为稳定同位素标记的雌酮
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种评估人体维生素D状态的方法，所述方法为检测人体尿液中Calcitroic acid的含量。2.一种检测尿液中Calcitroic acid的方法，其特征在于，所述的检测方法包括：S101待测样本：新鲜采集的人尿液样本；S102样本处理：S201，室温条件下，分别移取相同体积的系列浓度的标准品溶液、经预处理后的待测样本，分别加入内标溶液和方法稳定剂，充分混匀，所述内标为稳定同位素标记的雌酮；S202，往步骤S201处理后的所有样品中分别加入乙腈或甲醇溶液进行蛋白沉淀；S203，往步骤S202处理后的所有样品中分别加入0.5％～5％的甲酸
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水溶液进行稀释后离心；S204，将步骤S203处理后的所有样品上清液通过活化的固相萃取板进行萃取分离并洗脱，氮吹至干；S205，往所有氮吹干后的样品加入甲醇
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水溶液复溶；S206，取复溶的样品上清液进行液相色谱
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串联质谱分析；S103绘制校准曲线：通过各标准品标示浓度X，系列标准品与内标的峰面积比值Y，绘制校准曲线并拟合校准曲线方程；S104结果分析：分别将待检测人尿液样本中Calcitroic acid与内标峰面积比值代入校准曲线方程，计算待检测样本人尿液样本中Calcitroic acid的浓度。3.根据权利要求2所述的一种检测尿液中Calcitroic acid的方法，其特征在于：步骤S201中，加入内标溶液的同时加入方法稳定剂，所述方法稳定剂为铁鳌合剂。4.根据权利要求3所述的一种检测尿液中Calcitroic acid的方法，其中，方法稳定剂为50％甲醇
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水溶液配制的1,2
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二甲基
‑3‑
羟基
‑4‑
吡啶酮，浓度为50～150mM。5.根据权利要求2所述的一种检测尿液中Calcitroic acid的方法，其特征在于：所述的内标溶液为稳定同位素标记的雌酮<...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈靖，游怀舟，王梦婧，
申请(专利权)人：上海国际人类表型组研究院，
类型：发明
国别省市：