一种可用于低温沉积3D打印的脱细胞基质及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种可用于低温沉积3D打印的脱细胞基质及其制备方法和应用，属于组织工程再生医学领域。本发明专利技术提供的脱细胞基质的制备方法，包括如下步骤：(1)将动物组织进行脱细胞处理，得到脱细胞基质匀浆；(2)在所述脱细胞基质匀浆中加入乙酸溶液，搅拌，然后让部分乙酸挥发，得到所述脱细胞基质。本发明专利技术制备的脱细胞基质具有剪切变稀性和3D可打印性，可以实现脱细胞基质单一材料的3D打印。现脱细胞基质单一材料的3D打印。

【技术实现步骤摘要】
一种可用于低温沉积3D打印的脱细胞基质及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及组织工程再生医学领域，具体涉及的是一种可用于低温沉积3D打印的脱细胞基质及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]通过组织工程再生医学的方法再生修复损伤的组织或器官已成为发展趋势。3D打印技术由于可以对支架内部结构和形貌实现精确的控制，因此在再生医学领域备受青睐。生物材料墨水目前已成为制约3D打印再生医学领域发展的瓶颈。
[0003]脱细胞基质是通过对异体组织进行脱细胞处理，去除移植相关抗原，从而获得的一种具有一定生物活性的生物衍生材料。脱细胞基质由于很好地保留了天然细胞外基质的有效成分，可模拟细胞—细胞、细胞—基质之间相互作用的天然微环境，有效地调控细胞的行为和功能，因此被视为理想的生物材料墨水。但是，生物3D打印技术对生物墨水(生物材料)的性质、粘度、成型方式等均有较高的要求，并非所有的生物材料均具备可打印性。传统方法制备的软骨基质为匀浆状，在不复合其他材料的情况下，单纯的软骨基质依然难以实现3D打印。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种可用于低温沉积3D打印的脱细胞基质及其制备方法和应用，本专利技术的方法通过在基质匀浆悬浮液中加入乙酸溶液，从而实现了脱细胞基质的3D可打印性。
[0005]本专利技术首先提供了一种脱细胞基质的制备方法，包括如下步骤：
[0006](1)将动物组织进行脱细胞处理，得到脱细胞基质匀浆；
[0007](2)在所述脱细胞基质匀浆中加入乙酸溶液，搅拌，然后让部分乙酸挥发，得到所述脱细胞基质。
[0008]上述的制备方法中，所述动物组织为软骨组织、半月板组织、骨组织、肌腱、肌肉、韧带和皮肤中的任一种。
[0009]所述动物组织的脱细胞处理方法为物理法、化学法或酶法。
[0010]物理法主要指的是差速离心法、超临界流体法、反复冻融法等；化学法主要包括使用各种化学试剂，括酸、碱、非离子型除垢剂、离子型除垢剂、两性离子除垢剂等；酶法为采用胰蛋白酶、DNA酶、RNA酶等进行处理。
[0011]上述的制备方法，步骤(2)中，所述乙酸溶液的质量百分浓度为20％～100％；具体可为80％～100％。
[0012]所述乙酸溶液为不断滴加到所述脱细胞基质匀浆中，直至所述脱细胞基质匀浆由乳白色变为透明状为止。
[0013]上述的制备方法，步骤(2)中，所述搅拌的温度为0～8℃，时间为12～72h；
[0014]所述搅拌在密闭容器中进行；
[0015]所述乙酸挥发的方法为在抽风机下磁力搅拌挥发乙酸；
[0016]所述脱细胞基质的质量百分浓度为5～10％。
[0017]本专利技术还提供了上述制备方法制备得到的脱细胞基质。
[0018]所述脱细胞基质在低温沉积3D打印制备组织工程支架中的应用也属于本专利技术的保护范围。
[0019]进一步的，本专利技术还提供了一种脱细胞基质支架的制备方法，包括如下步骤：所述脱细胞基质作为打印墨水采用3D打印机进行打印；打印后将支架进行冷冻升华干燥，然后将支架置于交联剂中进行交联，再次冷冻升华干燥，得到所述脱细胞基质支架；
[0020]所述打印的温度为低温。
[0021]上述的制备方法中，所述低温的温度范围为
‑
10～
‑
80℃；具体可为
‑
20℃；
[0022]所述冷冻升华干燥的条件如下：真空度<100mTorr，温度
‑
20～
‑
60℃，时间12～72h；
[0023]所述交联剂为包括乙基
‑
二甲基胺
‑
丙基碳化二亚胺和n
‑
羟基琥珀酰亚胺的溶液；
[0024]具体的，所述交联剂的溶剂为乙醇、水、丙酮和氯仿中的至少一种；具体可为乙醇溶液；
[0025]所述交联剂中，所述乙基
‑
二甲基胺
‑
丙基碳化二亚胺的浓度可为10～100mmol/L；具体可为50mmol/L；n
‑
羟基琥珀酰亚胺的浓度可为10～100mmol/L；具体可为20mmol/L；
[0026]所述交联的温度为0～25℃，具体可为4℃；时间为12～72h，具体可为24h。
[0027]上述的制备方法在交联后还有去除多余交联剂的步骤；具体可为采用PBS缓冲液浸泡。
[0028]最后，本专利技术提供了上述的制备方法制备得到的脱细胞基质支架。
[0029]本专利技术具有如下有益效果：
[0030](1)本专利技术制备的脱细胞基质具有剪切变稀性和3D可打印性；本专利技术的方法选择的关键物质为乙酸，其既可以作为溶剂溶解软骨基质，又具有较高的凝固点(16.6℃)；可以使得脱细胞基质在深低温条件下瞬间凝固成型，实现3D打印；
[0031](2)传统的3D打印软骨基质都是需要复合其他材料(如海藻酸等)才具有3D可打印性，而本专利技术的方法可以实现脱细胞基质单一材料的3D打印；
[0032](3)本专利技术采用的低温沉积3D打印技术，打印过程都是在深低温过程中实现，可以避免传统打印高温给生物材料造成的活性破坏，充分暴露脱细胞基质的生物活性。
附图说明
[0033]图1为获取的软骨组织。
[0034]图2为实施例制备的脱细胞软骨基质匀浆。
[0035]图3为实施例1中制备的脱细胞软骨基质。
[0036]图4为实施例1制备的脱细胞软骨基质黏度
‑
剪切速率曲线。
[0037]图5为冷冻平台上的3D打印支架。
[0038]图6为实施例2制备的软骨基质支架的大体观和扫描电镜图。
[0039]图7为细胞接种到软骨基质支架上的细胞死活染色图；图中，绿色代表活细胞，红
色代表死细胞。
具体实施方式
[0040]下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。
[0041]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0042]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0043]下述实施例中所用Dnase和Rnase分别是DNA酶和RNA酶，购自美国Sigma公司；产品货号分别为Dnase 10104159001；Rnase 10109134001。
[0044]下述实施例所用磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲液)的配制方法如下：称取8.0g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液pH至7.4，最后加蒸馏水定容至1L，即可得0.01M PBS缓冲液。
[0045]实施例1、脱细胞软骨基质的制备
[0046](1)软骨基质的脱细胞处理
[0047]在实验动物手术台本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脱细胞基质的制备方法，包括如下步骤：(1)将动物组织进行脱细胞处理，得到脱细胞基质匀浆；(2)在所述脱细胞基质匀浆中加入乙酸溶液，搅拌，然后让部分乙酸挥发，得到所述脱细胞基质。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述动物组织为软骨组织、半月板组织、骨组织、肌腱、肌肉、韧带和皮肤中的任一种。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述动物组织的脱细胞处理方法为物理法、化学法或酶法。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述乙酸溶液的质量百分浓度为20％～100％；所述乙酸溶液为不断滴加到所述脱细胞基质匀浆中，直至所述脱细胞基质匀浆由乳白色变为透明状为止。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述搅拌的温度为0～8℃，时间为12～72h；所述乙酸挥发的方法为在抽风机下磁力搅拌挥发乙酸；所述脱细胞基质的质量百分浓度为5～10％。6.权利要求1
‑
5中任一项所述制备方法制备得到的脱细胞基质。7.权利要求6所述的脱细胞基质在低温沉积3D打印制备组织工程支架中的应用。8.一种脱细胞基质支架的制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈明学，周一新，郭全义，杨德金，邵宏翊，刘舒云，眭翔，张颂阳，
申请(专利权)人：北京积水潭医院，
类型：发明
国别省市：