一种生物体液中多种甾体激素的检测方法技术

本发明专利技术涉及G01N30/02领域，具体地，本发明专利技术涉及一种生物体液中多种甾体激素的检测方法。生物体液中多种甾体激素的检测方法，包括下面步骤：(1)标准溶液配制和样本前处理；配制同位素内标的激素类代谢物的标准溶液和同位素内标的尿液混合溶液；分别对同位素内标的尿液混合溶液以及同位素内标的激素类代谢物的标准溶液进行酶解和固液萃取、氮吹之后衍生化前处理，分别得到对照品溶液和试品溶液；(2)气相色谱质谱联用检测；(3)定量检测。本申请生物体液中多种甾体激素的检测方法，具有简单快速，前处理耗时短、精密度和灵敏度高、重现性好的特点。点。

【技术实现步骤摘要】
一种生物体液中多种甾体激素的检测方法


[0001]本专利技术涉及G01N30/02领域，具体地，本专利技术涉及一种生物体液中多种甾体激素的检测方法。

技术介绍

[0002]人尿液中内源性类固醇代谢物的研究是许多研究领域的一个重要课题，从检测运动员中合成代谢雄激素类固醇的滥用，到一系列生物标志物对疾病的诊断或是对激素水平的评估，都离不开对类固醇代谢物的研究。类固醇是由胆固醇衍生出来的分子，根据其结构和活性，可分为五类：雄激素、雌激素、糖皮质激素、盐皮质激素和孕激素。尿液中雄激素的定量在有些领域也具有重要意义，如评估几种病理条件或筛选睾酮相关类固醇激素的滥用。监测雌激素、孕酮和孕烯醇酮的代谢物对乳腺癌的研究、先天性肾上腺增生的诊断或产前筛查对影响胎儿的疾病的诊断具有重要意义。
[0003]分析化学尤其是质谱学技术的进步给同时测定多种激素化合物带来了可能。目前用于生物体液中多种激素的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)，气相色谱法(GC)、液相色谱质谱联用法(LCMS，LCMS
‑
MS)和气相色谱质谱联用法(GCMS，GCMS
‑
MS)。其中气相色谱串联三重四级杆质谱由于其高灵敏度、高通量、高选择性、宽线性范围等优点成为检测多种激素化合物的强有力的手段。气相色谱质谱联用技术在检测类固醇类激素化合物表现出明显的优势，例如，甾体激素化合物的低电离效率以及生物样品中的基质效应阻碍了液相色谱质谱法的应用；气相色谱的毛细管色谱柱比液相色谱柱具有更多的理论踏板数。数据表明，GC
‑
MS/MS在精度方面更为充分，并具有高特异性、高灵敏度和精确度等特点。类似地，通过对几种真实样品的分析，验证了该方法的适用性。在质谱检测之前通常要采用适当的前处理方法将样本进行基质消除，现有的检测方法存在前处理时间较长，准确性和可靠性较差，不宜批量处理等缺点。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中存在的一些问题，本专利技术第一个方面提供了一种生物体液中多种甾体激素的检测方法，包括下面步骤：
[0005](1)标准溶液配制和样本前处理；
[0006]配制同位素内标的激素类代谢物的标准溶液、同位素内标的尿液混合溶液、类固醇激素标准溶液；
[0007]分别对同位素内标的尿液混合溶液以及同位素内标的激素类代谢物的标准溶液进行酶解和固液萃取、氮吹之后衍生化前处理，分别得到对照品溶液和试品溶液；
[0008](2)气相色谱质谱联用检测；
[0009](3)定量检测。
[0010]在一种实施方式中，所述激素类代谢物包括睾酮、表睾酮、雄酮、本胆烷醇酮、11β
‑
羟基雄酮、孕二醇、5α
‑
雄烷二醇、5β
‑
雄烷二醇、脱氢表雄酮、双氢睾酮、雌二醇、雌酮、皮质
醇、四氢皮质醇中一种或多种。
[0011]优选的，类激素代谢物标准溶液中，雄酮、本胆烷醇酮和11β
‑
羟基雄酮标准品溶液浓度范围是10
‑
10000ng/ml；孕二醇标准品溶液的浓度范围是10
‑
1000ng/ml；睾酮、表睾酮、5α
‑
雄烷二醇、5β
‑
雄烷二醇、脱氢表雄酮、双氢睾酮、雌二醇、雌酮标准品溶液浓度范围是1
‑
100ng/ml；皮质醇、四氢皮质醇标准品溶液浓度范围是5
‑
100ng/ml。
[0012]优选的，同位素内标的激素类代谢物的标准溶液浓度为：睾酮
‑
d3，50ng/ml；表睾酮
‑
d3，50ng/ml；本胆烷醇酮
‑
d5，2000ng/ml；5α
‑
雄烷二醇
‑
d3，50ng/ml；5α
‑
雄烷二醇
‑
d5，50ng/ml；脱氢表雄酮
‑
d5，50ng/ml；双氢睾酮
‑
d3，50ng/ml；雌二醇
‑
d4，50ng/ml；皮质醇
‑
d4，50ng/ml。
[0013]所述一系列浓度梯度的激素代谢物标准溶液、同位素内标溶液在配制时是以甲醇作为稀释和定容溶剂。
[0014]在一种实施方式中，酶解和固液萃取、氮吹之后衍生化前处理过程包括：取待处理溶液，加入磷酸缓冲液和β
‑
葡萄糖醛酸酶，混匀水解后，将酶解后的溶液转移至固相萃取柱中，使用甲基叔丁基迷洗脱，收集洗脱液并吹干；然后加入混合衍生化试剂，振荡后转移至衍生化小瓶芯中封口，进行反应。
[0015]在一种实施方式中，所述固相萃取柱为2ml固相支持液液萃取柱。
[0016]在一种实施方式中，吹干方式为使用氮气吹干，吹干温度为55
±
2℃。
[0017]优选的，待处理溶液、磷酸缓冲液、β
‑
葡萄糖醛酸酶的添加量之间的关系为1ml：0.5ml：50μL。
[0018]优选的，混合衍生化试剂为烯醇式
‑
三甲基硅烷化试剂，其反应是借助N
‑
甲基
‑
N
‑
三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)与碘化铵作用生成的三甲基碘硅烷(TMSI)来完成的。
[0019]优选的，衍生化反应的温度是70
±
2℃，时间是30分钟。
[0020]在一种实施方式中，气相色谱升温程序为：起始温度为170
‑
200℃，以每分钟升高2
‑
5℃的速度升至220
‑
240℃，再以每分钟升高25
‑
35℃的速度升至300
‑
320℃，并在300
‑
320℃下保持1
‑
5分钟。
[0021]在一种优选的实施方式中，气相色谱升温程序为：起始温度为180℃，以每分钟升高3.3℃的速度升至231℃，再以每分钟升高30℃的速度升至310℃，并在310℃下保持2分钟。
[0022]优选的，气相色谱条件还包括：毛细管色谱柱HP
‑
1，17mx0.2mmx0.11μm，载气为氦气，恒压分流进样，分流比为10:1，碰撞气为氮气，流速为1.5ml/min，淬灭气为氦气，流速为2.25ml/min，进样口温度为280℃质谱接口温度为300℃。
[0023]在一种实施方式中，质谱条件为：离子源为EI源，轰击电压为70eV，离子源温度为230℃，四级杆温度为150℃，采集方式为多反应监测和选择离子共用模式。
[0024]优选的，质谱条件中14种激素类代谢物的检测离子对或选择离子为：432.1
→
209.2和432.1
→
301.2(睾酮，T)；432.1
→
209.2和432.1
→
301.2(表本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物体液中多种甾体激素的检测方法，其特征在于，包括下面步骤：(1)标准溶液配制和样本前处理；配制同位素内标的激素类代谢物的标准溶液、同位素内标的尿液混合溶液、类固醇激素标准溶液；分别对同位素内标的尿液混合溶液以及同位素内标的激素类代谢物的标准溶液进行酶解和固液萃取、氮吹之后衍生化前处理，分别得到对照品溶液和试品溶液；(2)气相色谱质谱联用检测；(3)定量检测。2.根据权利要求1所述生物体液中多种甾体激素的检测方法，其特征在于，酶解和固液萃取、氮吹之后衍生化前处理过程包括：取待处理溶液，加入磷酸缓冲液和β
‑
葡萄糖醛酸酶，混匀水解后，将酶解后的溶液转移至固相萃取柱中，使用甲基叔丁基迷洗脱，收集洗脱液并吹干；然后加入混合衍生化试剂，振荡后转移至衍生化小瓶芯中封口，进行反应。3.根据权利要求2所述生物体液中多种甾体激素的检测方法，其特征在于，所述混合衍生化试剂为烯醇式
‑
三甲基硅烷化试剂。4.根据权利要求2或3所述生物体液中多种甾体激素的检测方法，其特征在于，反应的条件为：70
±
2℃，30分钟。5.根据权利要求4所述生物体液中多种甾体激素的检测方法，其特征在于，待处理溶液、磷酸缓冲液、β
‑
葡萄糖醛酸酶的添加量之间的关系为1ml：0.5ml：50μL。6.根据权利要求5所述生物体液中多种甾体激素的检测方法，其特征在于，所述激素类代谢物包括睾酮、表睾酮、雄酮、本胆烷醇酮、11β
‑
羟基雄酮、孕二醇、5α
‑
雄烷二醇、5β
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：廖蕾，葛雨琦，刘梦攀，刘冰，孙皓旖，徐昕，陈佩杰，
申请(专利权)人：上海体育学院，
类型：发明
国别省市：