一种BVDV灭活疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种BVDV灭活疫苗及其制备方法，属于疫苗制备技术领域。本发明专利技术提供的制备BVDV灭活疫苗的方法，包括如下步骤：将BVDV毒株病毒液与过氧化氢溶液混合至过氧化氢的浓度为1％

【技术实现步骤摘要】
一种BVDV灭活疫苗及其制备方法


[0001]本专利技术属于疫苗制备
，尤其涉及一种BVDV灭活疫苗及其制备方法。

技术介绍

[0002]牛病毒性腹泻(粘膜病)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV)引起的一种接触性传染病，主要感染牛，也感染猪、羊、骆驼等其他生物，宿主范围较广。其中，牛、羊以消化道黏膜糜烂、腹泻、呼吸道疾病、繁殖障碍、免疫机能障碍、持续感染等为主要特征。牛病毒性腹泻病毒具有高感染率、高发病率和高死亡率，发病率可达50％，死亡率可达到90％。牛病毒性腹泻病毒的毒株包括致细胞病变型(cp型)BVDV标准株NADL毒株和非致细胞病变型(ncp型)BVDV分离株shz 132毒株。
[0003]疫苗免疫常是预防和控制牛病毒性腹泻(粘膜病)的重要措施，现阶段被正式认证过的牛病毒性腹泻病毒疫苗累计数量达到160余种，毒株的遗传以及抗原具有多样性，种类不同的疫苗在机体中能够发挥的作用也具有差异性，并且其副作用也不相同。其中灭活疫苗在使用过程中具有较好的安全性，具有较高的经济价值，可以有效的预防该病的发生和流行。相关研究证实，在接种BVDV疫苗以后，能够全面减少怀孕母牛流产、减少持续性感染流产等。病毒的灭活具有很多方法，物理方法有高温加热，紫外线灭活等；化学方法有甲醛灭活，β
‑
丙内酯(βPL)灭活等。这些方法虽然会有效灭活病毒的活力，但是对于病毒抗原性的破坏也是不可忽略的。考虑到上述灭活疫苗存在的种种问题，寻找合适的新灭活剂对疫苗的研制至关重要。H2O2是一种高效氧化剂，通常用作抗菌剂和防腐剂。目前还未有以H2O2作为灭活剂制备BVDV灭活疫苗的有关报道。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种采用H2O2制备BVDV灭活疫苗的方法，制备所得的BVDV灭活疫苗具有高安全性和免疫原性。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种制备BVDV灭活疫苗的方法，包括如下步骤：将BVDV毒株病毒液与过氧化氢溶液混合至过氧化氢的浓度为1％
‑
3％，灭活，得BVDV毒株灭活病毒液，将BVDV毒株灭活病毒液与弗氏佐剂混合，乳化得BVDV灭活疫苗。
[0007]优选的，所述BVDV毒株为BVDV NADL毒株。
[0008]优选的，所述BVDV毒株病毒液的浓度为10
6.6
TCID
50
/0.1mL。
[0009]优选的，所述BVDV毒株病毒液的制备方法包括如下步骤：将BVDV毒株接种至MDBK细胞中，进行病毒的扩繁，裂解MDBK细胞释放BVDV毒株，得BVDV毒株病毒液。
[0010]优选的，所述灭活的温度为27℃。
[0011]优选的，所述灭活的时间为2h
‑
8h。
[0012]优选的，BVDV毒株灭活病毒液与弗氏佐剂的体积比为1:1。
[0013]优选的，所述弗氏佐剂为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂的混合液。
[0014]更优选的，弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂的体积比为1:1。
[0015]本专利技术还提供了一种上述制备方法制备所得的BVDV灭活疫苗。
[0016]本专利技术的有益效果：
[0017]H2O2可以破坏脂质膜双层，氧化蛋白质骨架、氨基酸侧链并对核酸造成氧化损伤，诱导基因组RNA或DNA中的单链和双链断裂，是不可逆灭活机制。此外，本专利技术用H2O2作为BVDV疫苗灭活剂，由于H2O2可以分解成水和氧气从空气处理系统中排出，所以灭活BVDV毒株后即便是不进行后处理，也不会留下残留物。本专利技术用H2O2灭活BVDV毒株，不仅保留了BVDV病毒的免疫原性，而且在不影响其抗原性的情况下实现了不可逆地灭活BVDV病毒。与本领域常用的其他灭活剂相比，本专利技术采用H2O2灭活疫苗更安全、更有效。本专利技术将灭活完全后的病毒液用于灭活疫苗的制备，并且在小鼠上进行了免疫效果的验证，展示出安全、良好的免疫原性。
附图说明
[0018]图1为BVDV NADL株感染MDBK细胞后的病变情况(
×
400)，其中A为正常MDBK细胞，B
‑
D分别代表BVDV NADL株感染24h、48h和72h的结果；
[0019]图2为7％过氧化氢灭活的病毒液的细胞接种情况，其中A为7％过氧化氢灭活的病毒液组(
×
400)，B为MDBK阴性对照组(
×
400)；
[0020]图3为盲传三代后不同组别细胞接种情况，其中A为MDBK阴性对照组(
×
400)，B为BVDVNADL阳性对照组(
×
400)，C为灭活病毒液接种至MDBK细胞组(
×
400)；
[0021]图4为细胞培养物中5'
‑
UTR基因的PCR结果，其中M为DL 500DNA Marker，NC为阴性对照(MDBK正常细胞盲传三代后的细胞记为阴性对照)，1为正常细胞对照，2为阳性病毒对照，3为灭活病毒液盲传第三代的细胞培养物；
[0022]图5为过氧化氢灭活疫苗和甲醛灭活疫苗外观检验结果，上方两支为过氧化氢灭活疫苗，下方两支为甲醛灭活疫苗；
[0023]图6过氧化氢灭活疫苗和甲醛灭活疫苗稳定性检验结果，左侧为过氧化氢灭活疫苗，右侧为甲醛灭活疫苗；
[0024]图7为免疫小鼠血清BVDV特异性IgG抗体水平检测结果；
[0025]图8为免疫小鼠IFN
‑
γ分泌水平的动态变化；
[0026]图9为免疫小鼠IL
‑
4分泌水平的动态变化。
具体实施方式
[0027]本专利技术提供了一种制备BVDV灭活疫苗的方法，包括如下步骤：将BVDV毒株病毒液与过氧化氢溶液混合至过氧化氢的浓度为1％
‑
3％，灭活，得BVDV毒株灭活病毒液，将BVDV毒株灭活病毒液与弗氏佐剂混合，乳化得BVDV灭活疫苗。
[0028]在本专利技术中，所述BVDV毒株优选为BVDV NADL毒株。本专利技术使用BVDV CP型的NADL株，能引起培养细胞空泡形成及死亡，具有较强的免疫原性。在本专利技术中，所述BVDV毒株病毒液的制备方法优选的包括如下步骤：将BVDV毒株接种至MDBK细胞中，进行病毒的扩繁，裂解MDBK细胞释放BVDV毒株，得BVDV毒株病毒液。本专利技术对于MDBK细胞和BVDV毒株的具体来源没有特殊限定。在本专利技术中，将BVDV毒株接种至MDBK细胞中的具体方法优选为：待MDBK细
胞长成单层且融合度达到70％
‑
80％时，弃去原培养液，PBS清洗，加入无血清DMEM液，并按培养液体积与病毒液体积10:1的比例接种BVDV毒株，病毒吸附细胞2h后，更换为含体积分数为2％FBS的DMEM培养液继续培养。当BVDV毒株MDBK细胞病变达本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备BVDV灭活疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：将BVDV毒株病毒液与过氧化氢溶液混合至过氧化氢的浓度为1％
‑
3％，灭活，得BVDV毒株灭活病毒液，将BVDV毒株灭活病毒液与弗氏佐剂混合，乳化得BVDV灭活疫苗。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述BVDV毒株为BVDV NADL毒株。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述BVDV毒株病毒液的浓度为10
6.6
TCID
50
/0.1mL。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述BVDV毒株病毒液的制备方法包括如下步骤：将BVDV毒株接种至MDBK细胞中...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪伟，胡圣伟，姚瑞，李雅心，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：