EPCAM抗体与CAR-T细胞制造技术

本发明专利技术提供了具有不同亲和力的EpCAM抗体。本发明专利技术还提供了对EpCAM具有特异性的嵌合抗原受体(CAR)。包括对EpCAM具有低且足够亲和力的人EpCAM scFv的CAR T细胞可以避免靶向具有低EpCAM表达的健康组织，同时对具有高EpCAM表达的肿瘤组织表现出长期功效。本发明专利技术还涉及一种用于治疗癌症的过继性细胞疗法方法，所述过继性细胞疗法方法通过向患有癌症的受试者施用包括人EpCAM scFv的CAR

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】EPCAM抗体与CAR
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T细胞
[0001]参考序列表、表格或计算机程序
[0002]序列表作为ASCII格式的文本文件通过EFS
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Web与本说明书同时提交，文件名为Sequence Listing.txt，创建日期为2021年4月12日并且大小为11.5千字节。通过EFS
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Web提交的序列表是说明书的一部分，并且据此通过引用整体并入本文。


[0003]本专利技术涉及可用于肿瘤的过继性免疫基因疗法领域的EpCAM抗体和EpCAM
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CAR
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T细胞。本专利技术具体地涉及包括EpCAM单链可变片段的嵌合抗原受体，所述EpCAM单链可变片段对EpCAM具有足够的功能但亲和力低，这减轻了对正常组织的细胞毒性。

技术介绍

[0004]免疫疗法正在成为非常有前景的癌症治疗方法。
[0005]用CAR对T细胞进行基因修饰是设计肿瘤特异性T细胞的常用方法。可以将靶向肿瘤相关抗原的CAR(嵌合抗原受体)
‑
T细胞输注到患者体内(过继性细胞转移或ACT)，这代表高效的免疫疗法方法。与化疗或抗体相比，CAR
‑
T技术的优势在于，重新编程的工程化T细胞可以在患者体内增殖并持续存在并像活性药物一样发挥作用。
[0006]CAR分子由合成结合部分组成，所述合成结合部分通常是与由TCRζ链和如CD28和/或4
‑
1BB
1,2
等共刺激分子组成的细胞内信号传导结构域融合的源自抗体的单链片段可变(scFv)或任何天然抗原感应元件。CAR介导靶向的优势包含：1)与自然的非整合型TCR和共刺激信号传导相比，通过单个结合事件提供激活、增殖和顺式存活信号；2)通过非MHC依赖性抗原识别绕过肿瘤细胞对MHC的下调的能力；以及3)通过CAR与抗原
3,4
之间的高亲和力相互作用降低了激活阈值并能够识别低抗原密度的肿瘤细胞。
[0007]理想的CAR靶抗原应该是天然的表面暴露的肿瘤新抗原，所述肿瘤新抗原在肿瘤组织中高度表达并且在健康组织中不可检测。然而，由于此类抗原的隐式稀有性，许多通常靶向的实体肿瘤抗原也由非肿瘤组织表达，尽管水平较低。对此类抗原具有高亲和力的CAR分子可能导致健康组织的侧枝靶向，从而导致在靶脱肿瘤(on
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target,off
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tumor)毒性，这是迄今为止CAR T细胞疗法进展的主要限制因素。
[0008]常规CAR是使用单链抗体形式构建的，并被选择性地工程化成对靶抗原具有亚纳摩尔至低纳摩尔的亲和力。然而，只有当靶向真正的肿瘤抗原或那些具有最高水平限制的肿瘤抗原时，增加的CAR T细胞敏感度才可能是优势。否则，增加的敏感度是以在很大程度上对抗原密度不敏感的方式裂解表达靶标的细胞的选择性降低为代价的。
[0009]EpCAM(上皮细胞粘附分子)(CD326)抗原是由EpCAM基因编码的39
‑
40kDa细胞表面糖蛋白。EpCAM在细胞粘附、生长、增殖、炎症、癌症和转移中起关键作用。EpCAM在如乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌和结直肠癌等许多类型的肿瘤中高度过表达。EpCAM也在许多正常组织中表达，但其在肿瘤组织中的表达显著更高。
[0010]使用T细胞对抗癌症取决于最佳激活的T细胞，无论所述最佳激活的T细胞是内源
性的还是基因工程化的。T细胞持续暴露于抗原导致其衰竭，这是以细胞功能恶化为特征的状态。耗尽的T细胞表现出效应子功能的丧失，开始表达多种抑制蛋白并由改变的转录库定义。
[0011]高亲和力EpCAM CAR
‑
T细胞识别表达上皮细胞粘附分子的细胞：EpCAM水平低的正常上皮组织和以相当高水平表达所述EpCAM的癌。正常细胞、非靶细胞以及癌细胞上的抗原识别可能会导致不需要的毒性和T细胞衰竭。
[0012]需要具有改善的治疗指数的CAR，即，可以杀伤肿瘤同时使全身毒性最小化的CAR。
附图说明
[0013]图1A示出了UBS
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54huMab的重链可变区(V
H
，SEQ ID NO:1)。图1A还示出了UBS
‑
54(SEQ ID NO:2)的CDR
‑
H3和在CDR
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H3中具有丙氨酸取代的四个变体的CDR
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H3。D1A：SEQ ID NO:3。F3A：SEQ ID NO:4。L4A：SEQ ID NO:5，Y6A：SEQ ID NO:6。
[0014]图1B示出了EpCAM靶向CAR构建体的示意图。scFv组分是来自UBS
‑
54huMab或丙氨酸取代变体(D1A、F3A、L4A和Y6A)之一的序列。LTR＝长末端重复；SS＝信号序列；scFv＝单链可变片段；TMCyto＝跨膜和胞质结构域。
[0015]图1C示出了与在HEK293T细胞中表达的MYC标记的CAR结合的重组EpCAM。x轴：Alexa Fluor 647标记的重组EpCAM的结合。Y轴：抗MYC抗体的结合。
[0016]图1D示出了用于测量用不同的EpCAM靶向CAR转导的原代T细胞对靶标的杀伤的效应子与靶标(E:T)测定。每个靶标分别与不同的CAR T细胞或未经转导的T(NT)细胞以2.5:1的E:T比率温育。活力百分比相对于仅来自靶细胞的发光归一化。
[0017]图2A示出了UBS
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54CDR
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H3中的氨基酸取代的设计，用于微调EpCAM靶向CAR的亲和力。
[0018]图2B示出了与在HEK293T细胞中表达的MYC标记的CAR结合的重组EpCAM。x轴：Alexa Fluor 647标记的重组EpCAM的结合。Y轴：抗MYC抗体的结合。
[0019]图2C示出了用于测量用不同的EpCAM靶向CAR转导的原代T细胞对靶标的杀伤的效应子与靶标(E:T)测定。每个靶标分别与不同的CAR T细胞或未经转导的T(NT)细胞以1:1的E:T比率温育。细胞溶解百分比相对于仅来自靶细胞的发光归一化。
[0020]图2D使用实时细胞分析仪(RTCA)来测量EpCAM靶向CAR T对原代上皮细胞的杀伤。每个原代上皮细胞靶标分别与CAR T细胞或NT细胞以1:1的E:T比率温育。细胞溶解百分比相对于仅靶细胞归一化。X轴：时间，Y轴：细胞溶解百分比
[0021]图2E示出了在以E:T＝1:1与不同靶细胞共温育24小时之后通过ELISA测量的每个CAR T变体的IFN
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γ释放。
[0022]图2F示出了在以E:T＝1:1与不同靶细胞共温育24小时之后通过ELISA测量的每个CAR T变体的IL
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2释放。
具体实施方式
[0023]定义
[0024]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种与Ep
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CAM结合的抗体或其抗原结合片段，其中重链可变CDR3区具有氨基酸序列SEQ ID NO:6、7、8、3、5或9。2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中重链可变CDR1具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列，并且重链可变CDR2具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中轻链可变CDR1具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列，轻链可变CDR2具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列，并且轻链可变CDR3具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列。4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中V
L
包括SEQ ID NO:15或16的氨基酸序列，并且V
H
包括SEQ ID NO:17、18、19、20、21或22的氨基酸序列。5.根据权利要求1所述的抗原结合片段，其是单链可变片段(scFv)。6.根据权利要求5所述的scFv，其中所述重链可变CDR3区具有氨基酸序列SEQ ID NO:6、7或8。7.一种嵌合抗原受体融合蛋白(CAR)，...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨焕，金文秀，亚努什，
申请(专利权)人：艾弗依姆恩治疗公司，
类型：发明
国别省市：