用于糖基化的蛋白质的电泳的去糖基化方法技术

本公开涉及使用电泳分析翻译后修饰的感兴趣的蛋白质的方法，所述方法包含在标记后将感兴趣的蛋白质去糖基化。感兴趣的蛋白质去糖基化。感兴趣的蛋白质去糖基化。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于糖基化的蛋白质的电泳的去糖基化方法
[0001]相关申请交叉引用
[0002]本申请要求于2020年1月21日提交的美国临时专利申请系列第62/963,646号的优先权的权益，其内容据此通过引用以其整体并入本文。


[0003]本公开涉及生物化学、分子生物学和经由电泳分析蛋白质的领域。
[0004]序列表的通过引用并入
[0005]本文中以电子方式提交的文本文件的内容通过引用以其整体并入本文中：序列表的计算机可读格式副本(文件名：REGE
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019
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001WO_SeqList_ST25.txt，记录日期：2020年12月22日，文件大小1千字节)。

技术介绍

[0006]基于毛细管的电泳(CE)和基于微芯片的毛细管电泳(MCE)是制药行业常用的分析方法，其用于基于蛋白质大小表征治疗性蛋白质的完整性和纯度，并提供质量控制。虽然标准的、行业推荐的样品制备方法对许多蛋白质都很有效，但由于通过CE和MCE的差的分离和定量，高度糖基化的蛋白质是有问题的。此外，MCE图谱中的部分糖基化本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分析包含感兴趣的蛋白质的样品的方法，所述方法包含：a.使所述样品变性；b.用荧光标记物标记所述样品以产生标记的样品；c.淬灭所述标记的样品中的未反应的荧光标记物；d.用内切糖苷酶对所述标记的样品进行去糖基化；以及e.对所述标记的样品进行电泳；其中在步骤(d)中去糖基化之前，在步骤(a)至(c)中对所述样品进行变性、标记和淬灭。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质包含至少一个糖基化位点。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质是糖基化的蛋白质。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述糖基化的蛋白质包含至少一个附接的聚糖。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质包含抗原结合结构域。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质包含抗体、抗体片段或scFv。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质包含Fc结构域。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质包含受体融合蛋白。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述受体融合蛋白是受体
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Fc融合蛋白或可溶性TCR
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Fc融合蛋白。10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述受体融合蛋白是陷阱蛋白或微型陷阱蛋白。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质是重组人蛋白。12.根据权利要求2至11中任一项所述的方法，其中所述糖基化位点包含Asn
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X
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Ser/Thr共有序列。13.根据权利要求4至12中任一项所述的方法，其中所述至少一个附接的聚糖是N连接的。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述至少一个附接的聚糖与所述糖基化的蛋白质中的天冬酰胺N连接。15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述内切糖苷酶催化N
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连接的聚糖的去糖基化。16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述内切糖苷酶选自由肽
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N
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糖苷酶F(PNGase F)、内切糖苷酶H(Endo H)、内切糖苷酶S(Endo S)、内切糖苷酶D、内切糖苷酶F1、内切糖苷酶F2和内切糖苷酶F4组成的群组。17.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述内切糖苷酶是PNGase F。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述PNGase F是快速PNGase F。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述快速PNGase F是非还原性的。20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中对所述样品进行去糖基化包含将所述样品加热到约50℃持续10分钟。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中对所述样品进行去糖基化包含反应混合物，所述反应混合物在10μL反应体积(不包含快速PNGase F的体积)中包含0.2
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1.5mg的标记的感兴趣的蛋白质和1
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5μL的快速PNGase F。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述反应混合物包含0.2mg的标记的感兴趣的蛋白质。23.根据权利要求21所述的方法，其中所述反应混合物包含5μL的快速PNGase F。24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包含缓冲液。25.根据权利要求4至11中任一项所述的方法，其中所述至少一种聚糖是O
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连接的聚糖。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述内切糖苷酶催化O
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连接的聚糖的去糖基化。27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述内切糖苷酸酶包含内切
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α
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N
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乙酰半乳糖胺酶(O
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糖苷酶)。28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中用所述荧光标记物标记所述样品包含将所述样品加热到约35℃持续10
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30分钟。29.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中用所述荧光标记物标记所述样品包含将所述样品加热到约35℃持续约15分钟。30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中使用还原性溶液使所述样品变性。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述还原性溶液包含二硫苏糖醇(DTT)。32.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中使用非还原性溶液使所述样品变性。33.根据权利要求32所述的方法，其中所述非还原性溶液包含碘乙酰胺(IAM)。34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中使所述样品变性包含将所述样品加热到40℃至99℃持续1分钟至5小时。35.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中使所述样品变性包含将所述样品加热到50℃至99℃持续1分钟至60分钟。36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其中淬灭所述未反应的荧光标记物包含添加终止溶液。37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其进一步包含平行于所述样品分析参照标准品。38.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述电泳选自由凝胶电泳、等电聚焦、毛细管电泳(CE)或微芯片毛细管电泳(MCE)组成的群组。39.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述电泳是MCE。40.根据权利要求39所述的方法，其中所述MCE使用MCE仪器进行。41.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中当与使用在去糖基化后标记的样品生成的电泳图相比时，所述方法导致在小于20kDa范围内的减少的游离染料干扰和在电泳图中减少的或不存在的内切糖苷酶峰。42.根据权利要求41所述的方法，其中当与使用在去糖基化后标记的样品生成的电泳图相比时，所述内切糖苷酶峰减少至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
43.根据权利要求41所述的方法，其中当与使用在去糖基化后标记的样品生成的电泳图相比时，在电泳图中不存在所述内切糖苷酶峰。44.一种确定感兴趣的蛋白质的稳定性的方法，其包含：a.对包含所述感兴趣的蛋白质的样品进行应激；b.使所述应激的样品和包含所述感兴趣的蛋白质的非应激的样品变性；c.用荧光标记物标记所述应激的样品和所述非应激的样品，以产生标记的应激的样品和标记的非应激的样品；d.淬灭所述标记的应激的样品和所述标记的非应激的样品中的未反应的荧光标记物；e.用内切糖苷酶去糖基化所述标记的应激的样品和所述标记的非应激的样品；f.对所述标记的应激的样品和所述标记的非应激的样品进行微芯片毛细管电泳(MCE)，以生成所述应激的样品和所述非应激的样品的电泳图；以及g.比较来自所述应激的样品和所述非应激的样品的电泳图，从而确定所述感兴趣的蛋白质的稳定性；其中在步骤(e)中去糖基化之前，在步骤(b)...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵一鸣，H，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：