胸腺细胞在培养肌肉干细胞中的用途制造技术

本发明专利技术涉及胸腺细胞在培养肌肉干细胞中的用途。本发明专利技术提供胸腺细胞、其培养物、分泌物和/或其提取物在促进肌肉再生和/或修复、增加肌肉纤维的数量、增加肌肉干细胞的数量、抑制骨骼肌衰老等中的用途。本发明专利技术发现，由胸腺细胞制备的条件培养基可高效扩增肌肉纤维和肌肉干细胞，从而抑制骨骼肌衰老。从而抑制骨骼肌衰老。

【技术实现步骤摘要】
胸腺细胞在培养肌肉干细胞中的用途


[0001]本专利技术属于干细胞培养领域，具体涉及胸腺细胞在培养肌肉干细胞中的用途。

技术介绍

[0002]成年肌肉一直处于生长/衰竭的动态平衡之中，随着年龄的增加，肌肉生长速度明显大于衰竭速度，但在40岁后，肌肉每年以0.5％－2.0％的速度减少。成体干细胞更新是肌肉生长/衰竭动态平衡的关键调节环节，同时也是肌肉再生的保障。因此，保障机体肌肉干细胞池或扩增干细胞是防治衰老、肌肉损伤、肌肉遗传性疾病的关键技术，具有高度的实用价值。
[0003]肌肉成体干细胞主要为肌卫星细胞(Satellite cells)，其具有异质性，是目前研究核心细胞。肌卫星细胞群在机体发育的早期即已存在，其关键细胞标志是表达Pax7(Paired box transcription factor 7)转录因子；在胚胎期和出生后早期，肌卫星细胞参与新肌纤维发育，促进肌肉的形成；在出生后3周，当肌肉发育分化完成后，肌卫星细胞则停留于肌肉纤维周边，始终处于静止状态。研究发现，成体肌肉在生理状态下，肌卫星细胞存在于肌肉纤维基底膜下(Basal lamina)。该细胞体积小，处于G0期，表现为细胞分裂静息状态，此时细胞代谢也处于静止状态，称之为静息卫星细胞(Quiescent Satellite Cells，QSC)。当肌肉受损时，肌卫星细胞激活、增殖、分化，最后融合到肌纤维，形成再生纤维。在此过程中，肌卫星细胞由静息状态转变为激活状态(Active Satellite Cells，ASC)，其主要标记由Pax7
+
/MyoD
‑
转变成Pax7
+
/MyoD
+
。为了维持干细胞池的平衡，ASC可通过非对称分裂(Asymmetric division)的方式产生不同命运的子代，即部分子代细胞失去Pax7表达(Pax7
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/MyoD
+
)继而分化修复受损纤维，而另一些子代细胞下调MyoD表达(Pax7
+
/MyoD
‑
)逐渐退出细胞周期，回复到静息状态，再回到肌膜上的干细胞巢的位置成为新的QSC。以上动态过程循环往复，直至肌肉修复完成。这种更新机制是维持再生所必需的卫星细胞池的基础。但这种更新过程是如何被老龄化调控的尚不清楚。
[0004]数十年前，人们希望通过大量培养和回输肌肉干细胞来治疗肌肉疾病和退化，但均不成功。其主要原因是所培养的细胞以肌母细胞(Myoblast)为主，无法在体内持续增殖产生新的肌肉纤维。为避免这一问题，人们直接从肌肉纤维分离新鲜的QSC并回输机体，结果证实这种方法获得的干细胞可高效定植在干细胞巢中，并进入肌肉再生纤维。但这种方法最大的缺点在于获得新鲜QSC的效率很低，1克组织最多可得到10^4个干细胞，难以满足临床应用和基础研究的需要。
[0005]现有的肌卫星细胞培养方法获得的肌卫星细胞群中的非激活肌卫星细胞(Non Active Satellite Cells,NA
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SC)比例仍较少，限制了该细胞的广泛应用。本领域仍需能高效扩增肌卫星细胞的培养方法。

技术实现思路

[0006]专利技术人发现，胸腺细胞、其培养物、分泌物和/或其提取物可以促进肌肉再生。
[0007]因此，本专利技术第一方面提供胸腺细胞、其培养物、分泌物和/或其提取物在选自以下一项或多项中的用途或在制备用于选自以下一项或多项的试剂盒中的用途：促进肌肉再生和/或修复、增加肌肉纤维的单位横截面积、增加肌肉纤维的数量、上调肌肉组织或细胞中的成肌调节因子、上调肌肉组织或细胞中的肌球蛋白重链MHC、增加肌肉干细胞的数量、提高肌肉干细胞的增殖、维持肌肉干细胞池、促进肌肉干细胞的再生相关基因的表达、抑制肌肉干细胞的激活和/或分化、维持肌肉干细胞的干性、促进骨骼肌前体细胞在体外的扩增、抑制骨骼肌衰老。
[0008]在一个或多个实施方案中，所述胸腺细胞是哺乳动物胸腺细胞，例如人、小鼠、大鼠的胸腺细胞。
[0009]在一个或多个实施方案中，胸腺细胞是胸腺非淋巴细胞或胸腺淋巴细胞。
[0010]在一个或多个实施方案中，胸腺细胞包括胸腺未成熟淋巴细胞，优选胸腺未成熟T细胞。
[0011]在一个或多个实施方案中，胸腺细胞选自以下的一种或多种：CD45
+
CD3
+
细胞、CD45
+
CD3
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细胞、CD45
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CD3
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细胞、CD45
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CD3
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CD4
+
CD8
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细胞、CD45
+
CD3
+
CD4
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细胞、CD45
+
CD3
+
CD8
+
细胞、CD45
+
CD3
+
CD4
+
CD127
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CD25
+
细胞(Treg细胞)。
[0012]在一个或多个实施方案中，肌肉干细胞是肌卫星细胞或成肌细胞。
[0013]在一个或多个实施方案中，肌肉干细胞是Pax7阳性细胞。
[0014]在一个或多个实施方案中，肌肉干细胞是Pax7阳性且Myod阴性细胞。
[0015]在一个或多个实施方案中，再生相关基因包括Myh3、MyoD或MyoG。
[0016]在一个或多个实施方案中，成肌调节因子包括Myod和myogenin。
[0017]在一个或多个实施方案中，肌肉再生修复包括肌肉二次损伤的再生修复。
[0018]在一个或多个实施方案中，肌肉纤维是再生肌肉纤维。
[0019]在一个或多个实施方案中，所述胸腺细胞培养物是培养胸腺细胞的含细胞或无细胞培养基。
[0020]在一个或多个实施方案中，所述胸腺细胞分泌物和提取物是经培养的胸腺细胞的分泌物和提取物。
[0021]在一个或多个实施方案中，培养胸腺细胞的培养基包含基础培养基，例如F10培养基，DMEM培养基，F12培养基，RPMI 1640培养基。在一个或多个实施方案中，培养胸腺细胞的培养基还包含选自以下的一种或多种组分：FBS、L
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谷氨酰胺、青霉素、链霉素、β
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巯基乙醇、刀豆球蛋白A。优选地，各组分浓度分别为：1
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20％FBS、0.5
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2％L
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谷氨酰胺、0.5
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2％青霉素、0.5
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2％链霉素、20
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80μMβ
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巯基乙醇或1
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5μg/ml刀豆球蛋白A。更优选地，各组分浓度分别为：10％FBS、1％L
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谷氨酰胺、1％青霉素、链霉素以及50μMβ
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.胸腺细胞、其培养物、分泌物和/或其提取物在选自以下一项或多项中的用途或在制备用于选自以下一项或多项的试剂盒中的用途：促进肌肉再生和/或修复、增加肌肉纤维的单位横截面积、增加肌肉纤维的数量、上调肌肉组织或细胞中的成肌调节因子、上调肌肉组织或细胞中的肌球蛋白重链MHC、增加肌肉干细胞的数量、提高肌肉干细胞的增殖、维持肌肉干细胞池、促进肌肉干细胞的再生相关基因的表达、抑制肌肉干细胞的激活和/或分化、维持肌肉干细胞的干性、促进骨骼肌前体细胞在体外的扩增、抑制骨骼肌衰老，优选地，所述胸腺细胞培养物是培养胸腺细胞的含细胞或无细胞培养基，和/或所述胸腺细胞分泌物和提取物是经培养的胸腺细胞的分泌物和提取物，和/或所述再生相关基因包括Myh3、MyoD和/或MyoG，和/或所述成肌调节因子包括Myod和/或myogenin。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述胸腺细胞是胸腺未成熟淋巴细胞，和/或所述肌肉干细胞是肌卫星细胞或成肌细胞，优选地，所述胸腺细胞是胸腺未成熟T细胞，和/或所述肌肉干细胞肌肉干细胞是Pax7阳性细胞。3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，培养胸腺细胞的培养基包含基础培养基，并且任选包含选自以下的一种或多种组分：FBS、L
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谷氨酰胺、青霉素、链霉素、β
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巯基乙醇、刀豆球蛋白A，和/或所述胸腺细胞分泌物通过如下步骤获取：(1)对经培养的胸腺细胞的混合物进行固液分离，和任选的(2)阴离子柱层析分离、高效液相层析和/或质谱，和/或所述胸腺细胞提取物通过以下步骤获取：(1)对经培养的胸腺细胞进行细胞破碎，(2)固液分离，和任选的(3)DEAE纤维素阴离子柱层析分离、高效液相层析、质谱。4.一种条件培养基，包含胸腺细胞、其培养物、分泌物和/或其提取物，和任选的基础培养基，优选地，所述基础培养基包含F10培养基、DMEM培养基、F12培养基或RPMI 1640培养基，和/或所述条件培养基中胸腺细胞培养物占1
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100体积％，和/或所述条件培养基还包含FBS和/或碱性成纤维细胞生长因子，和/或所述胸腺细胞培养物是培养胸腺细胞的含细胞或无细胞培养基，和/或所述胸腺细胞分泌物和提取物是经培养的胸腺细胞的分泌物和提取物。5.如权利要求4所述的条件培养基，其特征在于，所述胸腺细胞是胸腺未成熟淋巴细胞，优选地，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱敏生，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：