黄花蒿提取物在制备干细胞凋亡抑制剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了黄花蒿素在制备间充质干细胞凋亡抑制剂中的应用。本发明专利技术以大鼠骨髓间充质干细胞为代表作为实验对象，以过氧化氢摸拟诱导间充质干细胞损伤，研究发现黄花蒿提取物在过氧化氢诱导的细胞损伤中具有保护作用，并初步探讨了黄花蒿提取物的保护作用机制，结果说明黄花蒿提取物通过抑制H2O2引起的p

【技术实现步骤摘要】
黄花蒿提取物在制备干细胞凋亡抑制剂中的应用


[0001]本专利技术涉及天然产物的新应用，特别涉及黄花蒿提取物在制备干细胞凋亡抑制剂中的应用。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(MSCs)是一种多能干细胞，具有自我更新和多向分化能力。又因其低免疫源性和可移植性，被认为是组织工程学的种子细胞。由于间充质干细胞在再生医学中的治疗潜力，人们对其分离、培养和鉴定产生了极大的兴趣。而培养活性高和足够量的间充质干细胞是实现其临床应用的前提。虽然现有技术中已经有较多技术公开了间充质干细胞的增殖培养方法，但是还是存在一些不足。以骨髓间充质干细胞( bone marrow mesenchymalstem cells，BMSCs)BMSCs为例，骨髓间充质干细胞移植是治疗缺血性脑和心脏组织的新方法之一。然而，由于活性氧（ROS）水平高，移植BMSCs在缺血组织中存活率低，限制了该方法的治疗效果。如在组织损伤的缺血部位ROS的病理水平被认为是导致移植BMSCs丢失的主要原因之一，因此，在骨髓间充质干细胞的培养、扩增、产生和归巢到损伤的组织微环境中时，有必要寻找能够操纵骨髓基质干细胞减少其自身ROS，降低干细胞死亡的方法，以促进骨髓基质干细胞的植入和组织修复。
[0003]黄花蒿（Artemisia aunnaL.）为一年生的草本菊科植物，别名草蒿、青蒿、臭蒿、犱蒿等。作为传统的中药之一，黄花蒿具有清热解毒、截疟抗菌等功效。有文献报道黄花蒿提取物所含有倍半萜类、黄酮类、挥发性油类和香豆素类等物质具有清热、解暑、截疟和健胃等功效。此外，黄花蒿提取物具有抗氧化、提高免疫能力、杀菌和抗病毒等功效（王鸿博，肖晥，华会明，等.黄花蒿的化学成分研究进展[J].现代药物与临床，2011，26(6)：430
‑
433）但黄花蒿提取物对干细胞的保护作用则未见报道。黄花蒿活性物质提取方法包括水提法、传统的有机溶剂提取（乙醇提取法）等，主要有提取液、粉末等形式。其中青蒿素及其衍生物、青蒿多糖和青蒿精油是黄花蒿提取物的主要有效成分。青蒿素类化合物主要为脂溶性成分，在黄花蒿中的含量较低。青蒿素类化合物通常对热比较敏感，同时几乎不溶于水，一般使用醇提或有机溶剂提取，提取方法不当，其结构极易被破坏或提取不到青蒿素类化合物。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供黄花蒿水提取物在制备干细胞凋亡抑制剂中的应用。
[0005]专利技术人研究发现黄花蒿提取物ZWH2880对H2O2诱导的BMSCs细胞毒性的保护作用。专利技术人发现黄花蒿提取物ZWH2880可以阻止线粒体膜电位的下降，减少细胞内ROS的产生，减少H2O2诱导的骨髓间充质干细胞凋亡。此外，黄花蒿提取物ZWH2880可能通过激活AKT和抑制MAPK途径保护BMSCs免受氧化损伤。这些结果提示黄花蒿提取物ZWH2880可能是一种预防和治疗骨髓间充质干细胞氧化损伤的潜在药物。
[0006]本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术的第一个方面，提供：
黄花蒿水提取物在制备干细胞凋亡抑制剂中的应用。
[0007]在一些实例中，所述黄花蒿水提取物的提取温度不低于50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、沸腾温度。
[0008]在一些实例中，所述黄花蒿水提取物的提取时间不少于30 min、1h、2h、3h、4h、5h。
[0009]在一些实例中，所述黄花蒿水提取物的制备方法包括以下步骤：1)取黄花蒿加入水充分浸泡，加热沸腾提取，取滤液；2)在药渣中加入水，加热沸腾提取，取滤液；3)合并两次提取得到的滤液，浓缩、干燥，得到黄花蒿水提取物。
[0010]在一些实例中，所述干细胞为间充质干细胞。
[0011]在一些实例中，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞。
[0012]本专利技术的第二个方面，提供：一种防止或减少干细胞凋亡的培养基，其添加有本专利技术第一个方面所述的黄花蒿水提取物。
[0013]在一些实例中，黄花蒿提取物的添加量为10～1000 μg/ml。
[0014]在一些实例中，所述干细胞为间充质干细胞。
[0015]在一些实例中，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞。
[0016]本专利技术的第三个方面，提供：一种防止或减少干细胞凋亡的培养方法，包括将干细胞接种在培养基中，培养过程中，培养基中添加有本专利技术第一个方面所述的黄花蒿水提取物。
[0017]在一些实例中，黄花蒿提取物的添加量为10～1000 μg/ml。
[0018]在一些实例中，所述干细胞为间充质干细胞。
[0019]在一些实例中，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞。
[0020]本专利技术的有益效果是：专利技术人研究发现，H2O2对BMSCs的损伤可以通过经黄花蒿提取物ZWH2880处理后得以显著的改善。黄花蒿提取物ZWH2880能阻止BMSCs线粒体膜电位下降，减少细胞内ROS的产生，减少H2O2引起的细胞凋亡。此外，黄花蒿提取物ZWH2880的干细胞保护作用可能通过激活AKT信号通路以及抑制H2O2引起的MAPK的上调来实现。另外黄花蒿提取物具有强的抗氧化作用，且毒副作用低，因此具有良好的应用前景。本专利技术为黄花蒿提取物在制备干细胞凋亡抑制剂中的应用提供实验基础，也说明了黄花蒿提取物在抗干细胞凋亡中的潜能。
附图说明
[0021]图1是BMSCs 的形态学观察及流式细胞术鉴定；（A）大鼠骨髓间充质干细胞。培养形态学，分离后第6天。（B）骨髓间充质标志物CD29、CD90和造血标志物CD45的表达水平。
[0022]图2是黄花蒿提取物ZWH2880对氧化氢诱导的BMSCs 细胞毒性的影响；（A）用H2O2（50～400μM）处理细胞24h，MTT法测定细胞活力。（B）以ZWH2880（10～1000μg/ml）处理BMSC细胞24h，MTT法测定细胞活力。ZWH2880与200μM的H2O2共孵育24h，用MTT法（C）和LDH法（D）分别测定细胞活力和LDH释放量。数据表示为三个独立实验的平均值
±
标准差。###p<0.001，**p<0.01***p<0.001。SD：标准差。
[0023]图3是黄花蒿提取物ZWH2880对过氧化氢引起的BMSCs线粒体膜电位的影响；（A）用
ZWH2880（300μg/ml）与200μM 的H2O2共孵育24h，用JC
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1法测定ΔψM。（B）为对（A）的定量分析。膜电位由红变绿反映了膜电位的下降。数据表示为三个独立实验的平均值
±
标准差。###p<0.001，***p<0.001。SD：标准差。
[0024]图4是黄花蒿提取物ZWH2880对过氧化氢诱导BMSCS细胞活性氧的影响；（A）用ZWH2880（300μg/ml）与200μM 的H2O2共孵育24h，测定细胞内ROS水平。（B）为对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.黄花蒿水提取物在制备干细胞凋亡抑制剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述黄花蒿水提取物的提取温度不低于50℃、60℃、70℃，沸腾温度。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述黄花蒿水提取物的提取时间不少于30 min、1h、2h。4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述黄花蒿水提取物的制备方法包括以下步骤：取黄花蒿加入水充分浸泡，加热沸腾提取，取滤液；在药渣中加入水，加热沸腾提取，取滤液；合并两次提取得到的滤液，浓缩、干燥，得到黄花蒿水提取物。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述干细胞为间充质干细...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑文华，林若虹，周文树，
申请(专利权)人：珠海澳大科技研究院，
类型：发明
国别省市：