软骨类器官诱导培养基及诱导方法技术

本发明专利技术涉及软骨类器官诱导培养基及诱导方法，软骨类器官诱导培养基至少包括诱导培养基一和诱导培养基二，诱导培养基一用于软骨中胚层类器官诱导阶段；诱导培养基二用于软骨类器官诱导阶段；诱导培养基一由重组人激活素A(Activin A)、chir99021、FGF2、FBS、ITS等成分溶解在DMEM/F12培养液中组成；诱导培养基二由抗坏血酸、BMP2、TGF

【技术实现步骤摘要】
软骨类器官诱导培养基及诱导方法


[0001]本专利技术涉及类器官培养
，尤其涉及软骨类器官诱导培养基及诱导方法。

技术介绍

[0002]软骨组织由软骨细胞和细胞间质组成，根据细胞间质的不同，可以把软骨分为：透明软骨、弹性软骨和纤维软骨。其中透明软骨主要包括关节软骨和肋软骨等，关节软骨是一种高度特化的组织，其细胞外基质主要由II、IX和XI型胶原和蛋白多糖组成，覆盖在骨骼末端，提供减震和润滑的作用。创伤/坏死后出现大面积的关节软骨缺损，软骨自愈能力的退化导致关节功能受损，最终诱发骨关节炎。据世界卫生组织统计，全世界约有3.55亿人患骨关节炎，我国约有1.2亿患者，发病率为13％左右，其中在50
‑
55岁以上的人群中，骨关节炎的发病率分别为50％和80％。临床上又可将骨关节炎分为原发性和继发性关节炎两类，原发性骨关节炎主要和年龄老化相关，而继发性骨关节炎主要与损伤、炎症、遗传和代谢等疾病相关，该疾病已严重威胁人类的健康和生活，给社会带来了沉重的经济负担。一般的物理疗法和药物治疗只能起到镇痛、抗炎和暂时症状缓解的作用，不能改善骨关节炎发病机制或逆转骨关节炎进程从而无法达到根本上的疾病治愈效果。自体软骨细胞移植是目前最为成功的修复关节软骨局部缺损的细胞治疗方法。然而，这种方法仅限于小于2cm2的关节软骨缺损，且需要牺牲健康的软骨来进行活检。此外，这种原代培养的软骨细胞在体外的增殖能力有限，难以适用于大规模的细胞治疗。
[0003]干细胞作为一种具有无限增殖和多潜能诱导分化的种子细胞，干细胞治疗已成为一种修复软骨缺陷的新选择，通过应用具有自我更新和多能分化潜力的人诱导多能干细胞(hiPSCs)进行细胞治疗，既可以克服组织细胞来源困难、体外扩增效率低等问题，还能够避免伦理和道德风险。人类胚胎干细胞(hESCs)和hiPSCs由于超强的分化能力可以分化为人体各个器官和组织所需的不同类型细胞，而软骨细胞的诱导方法也早在2015年就被报道，但目前还未见进一步发展。
[0004]近年来，类器官(Organoids)技术作为一颗“新星”在模型构建和细胞治疗等方面展现出了无限魅力，而类器官是衍生于干细胞或前体细胞的器官和组织特异性细胞的集合体。相比于体外培养的2D
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细胞，类器官在组织结构和细胞间连接等多方面保留了与原始组织更高的还原度，在细胞成分和组织架构上具备更高的丰富度，因此，类器官在不同疾病的疾病模拟、病理研究、药物开发和再生医学等方面，能够弥补现有细胞模型体系的多种不足，具有重大的研究和应用价值。基于此出发点，软骨类器官的建立无疑对骨关节炎和其它软骨相关疾病的研究和治疗具有非凡的意义，而目前相关的研究及报道较少。本专利技术的研究正是要从hiPSCs中成功诱导出软骨类器官。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，针对
技术介绍
中指出的问题，本专利技术提供软骨类器官诱导培养基及诱导方法，该诱导培养基及诱导方法能够获取稳定的人软骨类器官，在1
‑
2个月内形成体外软
骨类器官模型，对于骨关节炎、软骨发育不全等其它相关疾病的机制研究和临床治疗具有重大的应用价值。
[0006]为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种软骨类器官诱导培养基，至少包括诱导培养基一和诱导培养基二，所述诱导培养基一用于软骨中胚层类器官诱导阶段；所述诱导培养基二用于软骨类器官诱导阶段；
[0008]所述诱导培养基一按照各组分在其中的终浓度组成包括：重组人激活素A(Activin A)，10
‑
50ng/ml；chir99021，3
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5μM；FGF2，10
‑
50ng/ml；FBS，1％
‑
10％；ITS，1％
‑
5％；青霉素+链霉素双抗，1％；以上成分均溶于DMEM/F12培养液中；
[0009]所述诱导培养基二按照各组分在其中的终浓度组成包括：抗坏血酸(ascorbic acid)，10
‑
100ng/ml；BMP2，10
‑
20ng/ml；TGF
‑
β1，10
‑
20ng/ml；GDF5，10
‑
20ng/ml；FBS，1％
‑
5％；ITS，1％
‑
5％；Glutamax，1％
‑
5％；NEAA，1％
‑
5％；丙酮酸钠(Na pyruvate)，1％
‑
5％；青霉素+链霉素双抗，1％；以上成分均溶于DMEM培养液中。
[0010]优选地，所述诱导培养基二还包括：FGF2，10
‑
20ng/ml。
[0011]进一步地，所述诱导培养基还包括维持培养基，所述维持培养基用于软骨类器官维持培养阶段，其按照各组分在其中的终浓度组成包括：FBS，10％
‑
20％；青霉素+链霉素双抗，1％；以上成分均溶于DMEM培养液中。
[0012]第二方面，本专利技术提供一种软骨类器官诱导方法，是将hiPSCs采用上述培养基分阶段培养获得，所述分阶段至少包括：软骨中胚层类器官诱导阶段和软骨类器官诱导阶段，其中，软骨中胚层类器官诱导阶段采用上述诱导培养基一培养，软骨类器官诱导阶段采用上述诱导培养基二培养。
[0013]进一步地，所述诱导方法中，分阶段培养前还将hiPSCs进行增殖培养。
[0014]进一步地，所述诱导方法具体包括以下步骤：
[0015]步骤1，hiPSCs增殖培养：将hiPSCs细胞培养在培养皿中，培养基为增殖培养基，于37℃、5％CO2条件下培养至细胞密度为80％
‑
90％；
[0016]步骤2，hiPSCs消化：采用适量Accutase消化增殖培养完成的细胞，并于37℃孵育6
‑
8分钟，加入3
‑
4倍的增殖培养基终止消化，离心取细胞沉淀；
[0017]步骤3，拟胚体(EBs)形成：采用增殖培养基将细胞悬浮，于37℃、5％CO2条件下培养24
‑
48h，得到EBs；
[0018]步骤4，中胚层类器官诱导培养：将增殖培养基更换为诱导培养基一，继续培养3天，培养过程中每天进行换液；
[0019]步骤5，软骨类器官诱导培养：进一步将诱导培养基一更换为诱导培养基二，继续培养30
‑
40天，培养过程中每2
‑
3天进行换液。
[0020]进一步地，所述增殖培养基为E8或mTeSR
TM
1培养基，其中添加有1％的青霉素+链霉素双抗。
[0021]进一步地，所述hiPSCs增殖培养前，培养皿提前用100
×‑
500
×
稀释的Matrigel于37℃包被1
‑
2h，稀释Matrigel的液体为DME本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种软骨类器官诱导培养基，其特征在于：至少包括诱导培养基一和诱导培养基二，所述诱导培养基一用于软骨中胚层类器官诱导阶段；所述诱导培养基二用于软骨类器官诱导阶段；所述诱导培养基一按照各组分在其中的终浓度组成包括：重组人激活素A，10
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50ng/ml；chir99021，3
‑
5μM；FGF2，10
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50ng/ml；FBS，1％
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10％；ITS，1％
‑
5％；青霉素+链霉素双抗，1％；以上成分均溶于DMEM/F12培养液中；所述诱导培养基二按照各组分在其中的终浓度组成包括：抗坏血酸，10
‑
100ng/ml；BMP2，10
‑
20ng/ml；TGF
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β1，10
‑
20ng/ml；GDF5，10
‑
20ng/ml；FBS，1％
‑
5％；ITS，1％
‑
5％；Glutamax，1％
‑
5％；NEAA，1％
‑
5％；丙酮酸钠(Na pyruvate)，1％
‑
5％；青霉素+链霉素双抗，1％；以上成分均溶于DMEM培养液中。2.根据权利要求1所述的一种软骨类器官诱导培养基，其特征在于：所述诱导培养基二还包括：FGF2，10
‑
20ng/ml。3.根据权利要求1或2所述的一种软骨类器官诱导培养基，其特征在于：所述诱导培养基还包括维持培养基，所述维持培养基用于软骨类器官维持培养阶段，其按照各组分在其中的终浓度组成包括：FBS，10％
‑
20％；青霉素+链霉素双抗，1％；以上成分均溶于DMEM培养液中。4.一种软骨类器官诱导方法，其特征在于：是将hiPSCs采用权利要求1～3任意一项所述的培养基分阶段培养获得，所述分阶段至少包括：软骨中胚层类器官诱导阶段和软骨类器官诱导阶段，其中，软骨中胚层类器官...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹欢，朱宇，兰坚强，黄敏，
申请(专利权)人：创芯国际生物科技广州有限公司，
类型：发明
国别省市：