一种多功能磁性纳米微球及制备和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种多功能磁性纳米微球及制备和应用，属于细菌分离和富集领域。本发明专利技术在氨基化磁性纳米微球(MNP

【技术实现步骤摘要】
一种多功能磁性纳米微球及制备和应用


[0001]本专利技术属于细菌分离和富集领域，更具体地，涉及一种高效靶向分离和富集细菌的多粘菌素B功能化磁性纳米微球及制备和应用。

技术介绍

[0002]据世界卫生组织(WHO)统计，致病性细菌感染每年可能造成1330万人死亡，对全世界公共卫生安全构成极大威胁(Analyst,2012,137(15):3405
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3421)。致病菌种类繁多，感染途径多样，治疗药物众多，建立病原菌快速、精确检测方法，有助于更好地预防并治疗细菌感染(Mater Chem B,2017,5(44):8631
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8652)。病原菌检测包括活性检测和核酸检测两大方面。由于实际样品中的细菌含量不一，且其中的蛋白质、脂肪、酶反应抑制剂、离子等，均可影响细菌活性和核酸检测的灵敏度和准确性，往往需要从样本中分离富集靶细菌后，再进行活性和核酸检测，以保证检测的灵敏度、准确性和可靠性(Biosens and Bioelectron,2011,26(11):4368
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4374)。因此，开发简单快速方便，且可同时用于细菌活性和核酸快速检测的细菌分离富集材料和方法十分必要。
[0003]常用的病原菌富集方法主要包括选择性培养法、物理法和生物亲和法。细菌选择性培养富集仅针对特定细菌，通常需要2
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4天时间，耗时长，无法实现快速检测；物理方法主要有离心、过滤、超滤等，需要仪器设备基础，且它们更适用于细菌种群筛查，若进行特定细菌富集则特异性不够。而生物亲和法是利用细菌和固相载体上亲和分子之间的亲和作用实现分离，是一种温和、高效、简单的细菌分离富集方法。其中，磁性纳米微球MNP(Magnetic nanoparticle，MNP)具有超顺磁性，便于利用磁场进行分离操作，克服了其他纳米材料难以从样本基质中分离的问题。MNP具有高吸附容量，表面易于连接各种功能化基团，适合用于制备生物亲和材料。修饰MNP的识别分子中，抗体特异性强，但也有诸多缺点，如价格昂贵，所需孵育时间长，稳定性差等；生物大分子功能基团众多，在修饰过程中三维结构变性和随机分子取向可能使其生物活性下降；有机/无机分子通常为非特异性吸附，缺乏选择性。小分子抗生素对细菌具有选择性靶向作用，稳定性好，适合作为亲和分子。抗生素多粘菌素B(Polymyxin B，PMB)具有广谱细菌吸附性能。PMB侧链氨基与G
‑
外膜脂多糖脂质A的磷酸基团发生静电结合，同时第6、7位氨基酸和脂肪酰基侧链与脂质A的脂肪酸部分发生疏水相互作用，其对G
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的作用更强(见图1)，因此PMB在不同样本中对G
‑
和G
+
菌的特性有一定差异，但呈现较强的G
‑
靶向作用，价格便宜，适合用于制备样品预处理所用的功能化MNP。先前关于PMB的研究集中在抗菌领域(Sci Adv,2021,7(32)：eabj1577)，这限制了其在细菌吸附和细菌活性检测中的应用。此外，纳米颗粒间的空间位阻效应会降低细菌的吸附容量。因此，提高PMB功能化纳米微球的生物兼容性和降低其空间位阻效应是需要解决的难题。
[0004]聚多巴胺(PDA)由多巴胺自聚合所制备，具有大量亲水性羟基和氨基，具有良好的生物兼容性。MNP表面修饰PDA壳层既可以提供后续修饰所需的活性基团，又防止MNP与生物系统直接接触，提高MNP的生物相容性，这有助于解决PMB的细菌毒性的难题。聚乙二醇(PEG)是一种具有良好水溶性和生物相容性的线性长链高分子聚合物，具有多样功能基团。
较长的PEG侧链则会提供更多活性基团，可进一步减少空间位阻，这有助于提高MNP微球的吸附容量。因此，在MNP上依次修饰PDA和PEG，有助于提供后续修饰所需的活性基团，减少PMB对细菌的毒性和提高功能化MNP的细菌吸附容量，但目前尚无这种应用于细菌吸附和活性检测的依次修饰PDA和PEG的多粘菌素功能化MNP的报道。
[0005]细菌微生物的快速检测是当前迫切需要解决的难题。食品中常规的细菌活性检测如细菌培养、计数和生化试验等全部检测过程至少需要5天(Food,2021,10(10):2402)。而抗生素功能化MNP可以高效快速地富集细菌，有望实现细菌活性快速检测。现有的商用细菌核酸提取试剂盒的提取步骤繁杂，用时较长，约3
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6小时，影响了细菌核酸的快速检测。抗生素功能化MNP与核酸快速提取方法联合，有望实现细菌核酸快速检测。最简单快速的核酸提取方法是基于高温的直接裂解法即热裂法，该方法只使用沸水加热15min，简单快速，无需使用其他化学试剂。PDA、PEG和PMB具有很好的热稳定性(Food Chem,2022,379:132148和Small,2022,2106533)，这提供了MNP细菌吸附和热裂法联合应用的可能。当功能化MNP细菌吸附和热裂法联合应用时，可将细菌富集和细菌快速核酸提取有机结合，大大简化核酸提取步骤，用时大大缩短，且可除去样本中基质的干扰，提高快速提取细菌核酸的质量。例如，高温会导致样品中蛋白质变性后包裹核酸，也会促进酶反应抑制剂等的释放，降低核酸提取的质量，在含高蛋白的样品(如牛奶)中更为显著(Microb Pathog,2019,1 2 9:266
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270和Vet Res Forum,2017,8(1):55
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58)。利用功能化MNP分离细菌后，热裂法提取MNP上所结合细菌的核酸，则可以克服这一影响热裂法核酸提取的关键难题。
[0006]实际样品中往往同时存在多种细菌，目前缺少同时分离富集同一样品中不同种类细菌的方法和材料。为此，本专利技术利用PMB的广谱细菌结合性能，所制备的MNP
PDA
‑
PEG
‑
PMB
在样品基质相对简单的自来水和尿液样品中可同时有效吸附G
‑
和G
+
菌，在基质相对复杂的牛奶中只能吸附G
‑
菌。为实现对复杂样品中G
‑
和G
+
的高效富集，我们将MNP
PDA
‑
PEG
‑
PMB
与可靶向结合G
+
的万古霉素功能化MNP(MNP
PEG
‑
Van
)联合使用，实现了同时分离富集牛奶中G
‑
和G
+
菌之目的。通过以上设计，MNP
PDA
‑
PEG
‑
PMB
有望高效富集系列细菌，且可同时进行细菌活性和细菌核酸快速检测。

技术实现思路

[0007]针对抗生素功能化MNP在细菌活性和细菌核酸快速检测方面需要解决的主要问题，本专利技术首先制备具有高生物兼容性、低毒性、高吸附容量、高热耐受性的MNP
PDA
‑
PEG
‑
PMB
，所述多粘菌素功能本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多粘菌素功能化磁性纳米微球，其特征在于，所述多粘菌素功能化磁性纳米微球为氨基化磁性纳米微球表面修饰聚多巴胺壳层、聚乙二醇分子臂和多粘菌素B；所述聚多巴胺壳层包覆氨基化磁性纳米微球；所述聚乙二醇两端修饰有醛基，且两端的醛基分别与聚多巴胺壳层和多粘菌素B上的氨基连接。2.如权利要求1所述的多粘菌素功能化磁性纳米微球，其特征在于，所述氨基化磁性纳米微球为氨基化的四氧化三铁纳米微球或氨基化的三氧化二铁纳米微球。3.如权利要求1或2所述的多粘菌素功能化磁性纳米微球的制备方法，其特征在于，在氨基化磁性纳米微球表面，修饰聚多巴胺壳层后，依次连接分子臂聚乙二醇和多粘菌素B；所述分子臂聚乙二醇两端修饰有醛基，且两端的醛基分别与聚多巴胺壳层和多粘菌素B上的氨基连接。4.如权利要求3所述的多粘菌素功能化磁性纳米微球的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)在氨基化磁性纳米微球上修饰聚多巴胺壳层：将氨基化磁性纳米微球、多巴胺盐酸盐和乙二胺混合，生成的聚多巴胺包覆在氨基化磁性纳米微球表面；(2)修饰聚乙二醇分子臂：将步骤(1)得到的中间产物中加入两端修饰有醛基的聚乙二醇，该醛基与聚多巴胺上的氨基发生醛氨缩合反应；(3)修饰多粘菌素B：将步骤(2)得到的中间产物中加入多粘菌素B，充分混匀，随后加入氧化还原催化剂，使聚乙二醇...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕斌，宋暖，谭多，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：