本发明专利技术涉及一种分泌葡萄糖氧化酶的基因工程菌。该工程菌是采用毕赤酵母菌为宿主细胞，通过导入编码葡萄糖氧化酶(GOX)的基因或经过密码子优化的编码葡萄糖氧化酶(GOX)的基因，并通过强化表达毕赤酵母泛素化转运基因构建而得，该菌为高效分泌葡萄糖氧化酶的基因工程菌。本发明专利技术还涉及一种分泌葡萄糖氧化酶的基因工程菌的构建方法。该方法通过过表达与分泌表达相关的泛素化基因，增强了葡萄糖氧化酶的分泌表达水平，且操作简易，可应用高产葡萄糖氧化酶菌株的构建及葡萄糖氧化酶的工业化制备，具有很好的市场应用前景。具有很好的市场应用前景。具有很好的市场应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种分泌葡萄糖氧化酶的基因工程菌及其构建方法与应用
[0001]本专利技术属于基因重组
，涉及一种分泌葡萄糖氧化酶的基因工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
[0002]1928年，Muller首先从黑曲霉的无细胞提取液中发现葡萄糖氧化酶。20世纪七十年代，国内外对葡萄糖氧化酶拓展了充分的应用场景。
[0003]葡萄糖氧化酶(GOX)可固定在电极表面用来检测葡萄糖，经常用于医药领域检测血糖，迅速快捷方便。可用在食品领域脱除氧气而保护食品避免被空气中的氧气氧化，也可以去除食品中的葡萄糖而避免美拉德反应。
[0004]在酿酒行业，GOX用于降低酒精的浓度，而且还能够抑制造成酒类变质的醋酸菌和乳酸菌的生长，可以减少酒类中防腐剂的添加。葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶可以共固定化，可用来制备葡萄酸钠。
[0005]葡萄糖氧化酶在养殖动物的饲料中得到了充分的应用，投入到鸡饲料中，提高了肉鸡的存活率和采食率。在猪饲料中GOX可以减少母猪围产期综合征，提高断奶仔猪日增重。在牛羊饲料中GOX消除了奶牛围产期食欲消退、促进对饲料的消化吸收。
[0006]葡萄糖氧化酶在动植物体内含量较低，难以通过提取的手段满足庞大的需求。所以采取基因工程的手段生产，分离，提取，纯化得到高纯度的葡萄糖氧化酶，现工业菌株一般为黑曲霉和青霉。
[0007]利用基因工程手段研究葡萄糖氧化酶，通过基因改造酶的结构，比如易错PCR，DNA shuffle达到了一定的效果，尽管为GOX的生产提供了理论手段和技术支撑，但是仍不尽如人意。
[0008]现有的通过对毕赤酵母蛋白分泌途径进行过表达强化来增强异源蛋白分泌效率的方法中，相关蛋白分泌途径因子和外源蛋白相互作用的机理不清晰，需要试错才能判断哪种基因过表达才对酶活有促进作用，操作复杂，工作量极大，成本较高。
[0009]而异源蛋白在毕赤酵母中常采用强启动子，容易导致转运途径通路压力过大，进而存在大量目的蛋白无法顺利分泌到胞外，找到增强转运途径通路的方法具有极其重要的应用价值。
[0010]因此，目前存在的问题是需要构建成本低廉、快速、高效的产葡萄糖氧化酶的菌株。
技术实现思路
[0011]本专利技术要解决的问题是针对现有技术存在的不足提供一种分泌葡萄糖氧化酶的基因工程菌，该基因工程菌通过强化蛋白转运分泌途径来增强葡萄糖氧化酶分泌，且所分泌的葡萄糖氧化酶具有较高的酶活力。
[0012]本专利技术还提供一种分泌葡萄糖氧化酶的基因工程菌的构建方法，该方法能够强化
蛋白转运分泌途径，从而增强葡萄糖氧化酶的分泌，提高葡萄糖氧化酶的酶活，获取可用于发酵合成葡萄糖氧化酶的工业型菌株。
[0013]为此，本专利技术第一方面提供了一种分泌葡萄糖氧化酶的基因工程菌，其为含有泛素化转运基因和编码葡萄糖氧化酶(GOX)的基因或经过密码子优化的编码葡萄糖氧化酶(GOX)的基因的重组毕赤酵母菌。
[0014]根据本专利技术，所述泛素化转运基因包括内源性毕赤酵母泛素化转运基因，以及任选的外源性泛素化转运基因。
[0015]在本专利技术的一些实施例中，所述外源性泛素化转运基因来源于酿酒酵母。
[0016]在本专利技术的另一个实施例中，所述编码葡萄糖氧化酶(GOX)的基因来源于青霉菌(Penicillium Amagasakiense)，其Genebank登录号为AAD01493.1。
[0017]根据本专利技术，所述泛素化转运基因优选为内源性毕赤酵母泛素化转运基因。
[0018]在本专利技术的一些实施例中，所述内源性毕赤酵母泛素化转运基因包括SEC12、SEC13、SEC23、SEC24和SEC31基因中的一种或几种。
[0019]具体地，所述SEC12基因的Genebank登录号为AF216960.1；
[0020]和/或，SEC13基因的Genebank登录号为AAB01155.2；
[0021]和/或，SEC23基因的Genebank登录号为CAY67406.1；
[0022]和/或，SEC24基因的Genebank登录号为CAY71741.1；
[0023]和/或，SEC31基因的Genebank登录号为CAY68066.1。
[0024]根据本专利技术，所述基因工程菌由泛素化转运基因和葡萄糖氧化酶(GOX)基因或经过密码子优化的编码葡萄糖氧化酶(GOX)的基因通过载体质粒在毕赤酵母GS115中过表达构成。
[0025]在本专利技术的一些实施例中，所述编码葡萄糖氧化酶(GOX)的基因或经过密码子优化的编码葡萄糖氧化酶(GOX)的基因通过PPIC9K质粒整合到毕赤酵母菌中。
[0026]在本专利技术的另一个实施例中，所述泛素化转运基因通过PGAPZB质粒整合到毕赤酵母中。
[0027]本专利技术中，所述毕赤酵母菌为毕赤酵母菌GS115。
[0028]本专利技术第二方面提供了如本专利技术第一方面所述的分泌葡萄糖氧化酶的基因工程菌的构建方法，其包括：
[0029]步骤A，通过第Ⅰ载体质粒将编码葡萄糖氧化酶(GOX)的基因或经过密码子优化的编码葡萄糖氧化酶(GOX)的基因整合到毕赤酵母菌中，获得含有葡萄糖氧化酶(GOX)基因或经过密码子优化的编码葡萄糖氧化酶(GOX)的基因的毕赤酵母菌；
[0030]步骤B，通过第Ⅱ载体质粒将泛素化转运基因整合到含有葡萄糖氧化酶(GOX)基因或经过密码子优化的编码葡萄糖氧化酶(GOX)的基因的毕赤酵母菌中，获得分泌葡萄糖氧化酶的基因工程菌。
[0031]在本专利技术的一些实施例中，所述第Ⅰ载体质粒为PPIC9K质粒。
[0032]在本专利技术的另一些实施例中，所述第Ⅱ载体质粒为PGAPZB质粒。
[0033]本专利技术第三方面提供了如本专利技术第一方面所述的基因工程菌或由本专利技术第二方面所述的方法构建的基因工程菌在发酵生产葡萄糖氧化酶(GOX)中的应用。
[0034]在本专利技术的一些实施例中，所述应用包括将分泌葡萄糖氧化酶的基因工程菌接入
发酵培养基，进行发酵培养，获得葡萄糖氧化酶。
[0035]在本专利技术的一些具体的实施例中，所述发酵培养条件为：发酵温度为28℃，接种量为8％，转速500rpm，通气量为1.5vvm，pH值为5.5，培养基为BMGY培养基，待溶氧上升后加入甲醇，甲醇浓度控制在5g/L，发酵时间≥240h，所述葡萄糖氧化酶的酶活力≥1638.96U/mL。
[0036]本专利技术的有益效果在于：
[0037](1)本专利技术所提供的分泌葡萄糖氧化酶的基因工程菌通过强化蛋白转运分泌途径来增强葡萄糖氧化酶分泌，且所分泌的葡萄糖氧化酶具有较高的酶活力。
[0038](2)本专利技术所提供的分泌葡萄糖氧化酶的基因工程菌的构建方法通过强化表达毕赤酵母转运基因，解决葡萄糖氧化酶基因表达在毕赤酵母中的转运和分泌通路有限的问题。
[0039](3)本专利技术仅仅需要表达两个基因，例如，GOX基因和SEC12基因，操作更为简单，应用本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种分泌葡萄糖氧化酶的基因工程菌，其为含有泛素化转运基因和编码葡萄糖氧化酶(GOX)的基因或经过密码子优化的编码葡萄糖氧化酶(GOX)的基因的重组毕赤酵母菌。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述泛素化转运基因包括内源性毕赤酵母泛素化转运基因，以及任选的外源性泛素化转运基因；优选地，所述外源性泛素化转运基因来源于酿酒酵母；和/或，所述编码葡萄糖氧化酶(GOX)的基因来源于青霉菌(Penicillium Amagasakiense)，其Genebank登录号为AAD01493.1。3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述泛素化转运基因优选为内源性毕赤酵母泛素化转运基因；优选地，所述内源性毕赤酵母泛素化转运基因包括SEC12、SEC13、SEC23、SEC24和SEC31基因中的一种或几种；进一步优选地，所述SEC12基因的Genebank登录号为AF216960.1；和/或，SEC13基因的Genebank登录号为AAB01155.2；和/或，SEC23基因的Genebank登录号为CAY67406.1；和/或，SEC24基因的Genebank登录号为CAY71741.1；和/或，SEC31基因的Genebank登录号为CAY68066.1。4.根据权利要求1
‑
3中任意一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌由泛素化转运基因和葡萄糖氧化酶(GOX)基因或经过密码子优化的编码葡萄糖氧化酶(GOX)的基因通过载体质粒在毕赤酵母GS115中过表达构成。5.根据权利要求4的基因工程菌，其特征在于，所述编码葡萄糖氧化酶(GOX)的基因或经过密码子优化的编码葡萄糖氧化酶(G...
【专利技术属性】
技术研发人员：谭天伟，陈浩，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。