一种用于对虾细胞长期培养和连续传代的培养基制造技术

本发明专利技术提供一种用于对虾细胞长期培养和连续传代的培养基，首先提供一种对虾细胞培养用的基础培养基，是用2～5

【技术实现步骤摘要】
一种用于对虾细胞长期培养和连续传代的培养基


[0001]本专利技术属于动物细胞培养
，具体涉及一种用于对虾细胞长期培养和连续传代的培养基，可用于对虾细胞的体外长期培养及细胞系的建立。

技术介绍

[0002]对虾作为一种重要的海水养殖经济物种，因味道鲜美和营养丰富而备受欢迎。然而，各种疾病的频繁爆发，特别是病毒性疾病，给对虾养殖业带来了沉重的损失。体外培养的对虾细胞，特别是连续培养的对虾细胞系，是开展对虾病毒及其致病机理研究所不可或缺的研究工具与手段。对虾细胞培养方面的研究报道最早开始于Chen等(1986)，至今已有近40年历史，尽管科学家们已在对虾细胞的体外培养方面进行了许多努力，但由于用于对虾细胞培养的培养基不合适，至今没有成功地建立起永生性对虾细胞系。
[0003]目前用于对虾细胞体外培养的培养基大多是在哺乳动物或昆虫细胞培养基的基础上加以改良而来。其中，Leibovitz's L
‑
15(L
‑
15)培养基是最常用的。之前实验表明2
×
L
‑
15培养基中添加15％
‑
20％胎牛血清(FBS)和10％
‑
20％对虾肌肉提取液，以及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)和胰岛素样生长因子
‑
1(IGF
‑
1)等可以获得较好的培养效果。然而，之前的工作表明，2
×
L
‑
15培养基在低温保存后容易过饱和，析出沉淀，且不能再次溶解。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种用于对虾细胞长期培养和连续传代的培养基，该培养基能够更好地维持对虾细胞在体外的长期存活和生长，使对虾细胞的传代工作更容易进行，从而解决了体外培养对虾细胞的连续传代问题，从而能够建立对虾细胞系。
[0005]本专利技术首先提供一种对虾细胞培养用的基础培养基，是用2～5
×
/倍浓度的对虾血清氨基酸混合物替换1.5
×
L
‑
15培养基中的氨基酸组分，并添加50～100
×
浓度的对虾血清糖类混合物，同时添加终浓度为70
‑
86g/L的明胶；
[0006]作为优选，所述的基础培养基，是用5
×
的对虾血清氨基酸混合物替换1.5
×
L
‑
15培养基中的氨基酸组分；
[0007]作为优选，所述的基础培养基，是添加100
×
浓度的对虾血清糖类混合物；并添加86g/L的明胶。
[0008]作为实施例的一种具体记载，所述的对虾细胞培养用的基础培养基，其包含有如下终浓度的组分：
[0009]1)氨基酸：丝氨酸32
‑
40mg/L、缬氨酸16
‑
20mg/L、赖氨酸136
‑
171mg/L、胱氨酸20
‑
23mg/L、亮氨酸72
‑
90mg/L、甘氨酸137
‑
172mg/L、牛磺酸665
‑
829mg/L、脯氨酸1213
‑
1518mg/L、丙氨酸164
‑
205mg/L、酪氨酸5
‑
6mg/L、鸟氨酸15
‑
18mg/L、精氨酸227
‑
284mg/L、组氨酸25
‑
28mg/L、苏氨酸12
‑
15mg/L、蛋氨酸6
‑
8mg/L、谷氨酸79
‑
98mg/L、异亮氨酸45
‑
57mg/L、β
‑
丙氨酸4
‑
5mg/L、天冬酰胺131
‑
164mg/L、天冬氨酸43
‑
54mg/L、苯丙氨酸35
‑
43mg/L、羟脯氨酸50
‑
63mg/L、γ
‑
氨基丁酸3mg/L、谷氨酰胺300mg/L、色氨酸20mg/L和半胱氨酸120mg/L；
[0010]2)糖类：木糖4
‑
6mg/L、岩藻糖7mg/L、核糖24
‑
28mg/L、葡萄糖905
‑
936mg/L、蔗糖63
‑
69mg/L、乳糖11
‑
18mg/L、果糖4
‑
6mg/L、阿拉伯糖18
‑
19mg/L、海藻糖224
‑
234mg/L、龙胆二糖81
‑
88mg/L和半乳糖900mg/L；
[0011]3)维生素：肌醇2mg/L、叶酸1mg/L、烟酰胺1mg/L、氯化胆碱1mg/L、D
‑
泛酸钙1mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、磷酸硫胺素1mg/L和核黄素
‑5‑
磷酸钠0.1mg/L；
[0012]4)无机盐：KCl 400mg/L、NaCl 8g/L、CaCl
2 140mg/L、MgCl
2 93.7mg/L、MgSO
4 97.7mg/L、KH2PO
4 60mg/L、Na2HPO
4 190mg/L和NaHCO
3 1g/L；
[0013]5)其他营养物质：明胶86g/L、NaHCO
3 1g/L、丙酮酸钠550mg/L、青霉素钠100IU/mL、硫酸链霉素100IU/mL、两性霉素B 0.25mg/L和酚红10mg/L；
[0014]渗透压为620
±
20mOsm
·
kg
‑1，pH值为7.2
±
0.2。
[0015]本专利技术再一个方面还提供一种对虾细胞生长培养基，是在上述的基础培养基中添加对虾卵巢提取液和眼柄的水提取液；
[0016]作为优选，在基础培养基中添加20％卵巢提取液和4％眼柄提取液。
[0017]更进一步的，所述的对虾细胞生长培养基，还添加有15％FBS(v/v)、20μg/L表皮生长因子(EGF)和20μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)以及抗生素溶液。
[0018]所述的抗生素，作为实施例的具体记载，是青霉素钠100IU/mL、硫酸链霉素100IU/mL和两性霉素B 0.25mg/L；
[0019]本专利技术还提供一种传代培养对虾细胞系的方法，是使用上述的对虾细胞最适生长培养基来培养对虾细胞；
[0020]作为优选，所述的对虾细胞，为对虾的前血细胞。
[0021]应用本专利技术所提供的对虾细胞基础培养基(SBM)和生长培养基(SGM)开展刀额新对虾(Metapenaeus ensis)血淋巴细胞(MeH)的体外培养，可获得以下培养结果：
[0022]1)MeH细胞可在接种后本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对虾细胞培养用的基础培养基，其特征在于，所述的基础培养基是用2～5
×
/倍浓度的对虾血清氨基酸混合物替换1.5
×
L
‑
15培养基中的氨基酸组分，并添加50～100
×
浓度的对虾血清糖类混合物，同时添加浓度为70
‑
86g/L的明胶。2.如权利要求1所述的基础培养基，其特征在于，所述的基础培养基，是用5
×
的对虾血清氨基酸混合物替换1.5
×
L
‑
15培养基中的氨基酸组分。3.如权利要求1所述的基础培养基，其特征在于，所述的基础培养基，是添加100
×
浓度的对虾血清糖类混合物。4.如权利要求1所述的基础培养基，其特征在于，所述的基础培养基，是添加86g/L的明胶。5.如权利要求1所述的基础培养基，其特征在于，所述的基础培养基，其包含有如下终浓度的组分：1)氨基酸：丝氨酸32
‑
40mg/L、缬氨酸16
‑
20mg/L、赖氨酸136
‑
171mg/L、胱氨酸20
‑
23mg/L、亮氨酸72
‑
90mg/L、甘氨酸137
‑
172mg/L、牛磺酸665
‑
829mg/L、脯氨酸1213
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1518mg/L、丙氨酸164
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205mg/L、酪氨酸5
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6mg/L、鸟氨酸15
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18mg/L、精氨酸227
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284mg/L、组氨酸25
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28mg/L、苏氨酸12
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15mg/L、蛋氨酸6
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8mg/L、谷氨酸79
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98mg/L、异亮氨酸45
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57mg/L、β
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丙氨酸4
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5mg/L、天冬酰胺131
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164mg/L、天冬氨酸43
‑
54mg/L、苯丙氨酸35
‑
43mg/L、羟脯氨酸50
‑
63mg/L、γ
‑
氨基丁酸3mg/L、谷氨酰胺...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭华荣，赵亚琦，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：