Raffaelealauricola次级代谢产物的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种Raffaelea lauricola次级代谢产物的制备方法及其应用，包括：活化菌株，初级培养，次级培养，菌体研磨，乙酸乙酯萃取，浓缩得粗提物，将粗提物进行反相硅胶柱层析，以甲醇：水梯度洗脱，再通过多次200

【技术实现步骤摘要】
Raffaelea lauricola次级代谢产物的制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于从菌株分离活性物质的
，具体涉及Raffaelea lauricola次级代谢产物（藿烷型三萜类化合物A'
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ol）的制备方法及其抑制人乳腺癌细胞株MCF
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7的新用途。

技术介绍

[0002]Raffaelea lauricola是食菌小蠹（Ambrosia beetle）携带的高致病性伴生真菌，是导致树木枯萎病的病原真菌，学者们长期致力于研究其致病机理，伴随着研究的持续深入，已在该属其他物种中获得一些抑制植物生长、抗菌等活性物质。这预示该菌在生物农药或医药上潜在极大应用价值。
[0003]A'
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ol是藿烷型三萜类物质，而藿烷型三萜类物质多具有抗肿瘤、抗炎、抗菌等活性。可以修饰A'
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ol的化学结构进而生成各种新的活性物质。到目前为止，尚未发现在Raffaelea lauricola中分离到A'
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ol的报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种Raffaelea lauricola次级代谢产物及其抑制人乳腺癌细胞株MCF
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7的新用途，所述代谢产物为：藿烷型三萜类化合物A'
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ol。
[0005]所述Raffaelea lauricola次级代谢产物的制备方法，采取的技术方案如下：1)将Raffaelea lauricola活化后，取菌块接种到PDB培养基中，在，在140～180 r/min、20~28℃条件下连续培养5~10天，按15wt%~20wt%接种量转接到改良的大米培养基中，继续在20～28℃条件下静置培养28～40天，得到菌丝体。
[0006]2）将步骤1）得到的菌丝体在室温下干燥后研磨粉碎，用1~2倍体积的乙酸乙酯浸泡12~24小时，超声40~60分钟，收集萃取液，残渣中再加入菌丝体1~2倍体积的乙酸乙酯，超声40~60分钟，收集萃取液，重复以上步骤，共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏。
[0007]3）将浸膏用氯仿或二氯甲烷溶解，然后用反相硅胶C
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进行拌样，干法装柱，以甲醇：水体积比1:9
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9:1梯度洗脱，收集甲醇：水体积比为9:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得组分A。
[0008]4）用1倍体积的氯仿溶解组分A，过200
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300 目硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯体积比为30:1 开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比为10:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得浸膏，再过200
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300目硅胶柱，以石油醚：氯仿体积比为8:1开始梯度洗脱，收集石油醚:氯仿体积比4:1部分洗脱液，再过200
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300目硅胶柱层析，以石油醚：乙酸乙酯体积比为20:1开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比为5:1部分洗脱液，旋蒸得到白色粉末状A'
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ol，其结构式如下所示：
。
[0009]进一步地，所述步骤1）中改良的大米培养基的组成为：大米100 g,木屑10 g，加入纯水120 mL，121℃高压灭菌20 min。
[0010]进一步地，所述步骤1）中接种菌块的大小为0.5
×
0.5 cm，接种量为4块。
[0011]进一步地，所述步骤2）中超声的功率为400 W，频率为35 KHz。
[0012]进一步地，所述步骤3）中使用的反相硅胶C
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粒径40
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60 μm，孔径120
ꢀÅ
。
[0013]进一步地，所述步骤4）中梯度洗脱中石油醚：乙酸乙酯体积比依次为30:1, 20:1, 10:1, 7:1, 5:1；石油醚：氯仿体积比依次为8:1, 6:1, 4:1。
[0014]本专利技术的显著优点：本专利技术分离纯化简单，成本低，易操作；制得的化合物纯度高，且重复性好。
附图说明
[0015]图1为A'
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ol的1H NMR谱（CDCl3）；图2为A'
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ol的
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C NMR谱（CDCl3）；图3为A'
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ol的DEPT135谱（CDCl3）；图4为A'
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ol的COSY谱（CDCl3）；图5为A'
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olHMBC谱（CDCl3）；图6为A'
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ol的HSQC谱（CDCl3）。
具体实施方式
[0016]为让本专利技术的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，作详细说明。本专利技术的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。
[0017]本专利技术所使用的Raffaelea lauricola菌株编号为Hulcr7161。
[0018]实施例1活性次级代谢产物A'
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ol的分离1)取Raffaelea lauricola（本实验室保存菌株）为材料，无菌条件下挑取大小为0.5
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.Raffaelea lauricola次级代谢产物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1）将Raffaelea lauricola活化后，取菌块接种到PDB培养基中，在160～180 r/min、20~28℃条件下连续培养5~10天，按15wt%~20wt%接种量转接到大米培养基中，继续在20～28℃条件下静置培养28～40天得到菌丝体；2）将步骤1）得到的菌丝体在35~40℃下干燥后研磨成粉状，用1~2倍体积的乙酸乙酯浸泡12~24小时，超声40~60分钟，收集萃取液，残渣中再加入菌丝体1~2倍体积的乙酸乙酯，超声40~60分钟，收集萃取液重复以上步骤，共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏；3）将粗提物浸膏用氯仿或二氯甲烷溶解，然后用反相硅胶C
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进行拌样，干法装柱，以甲醇：水体积比1:9
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9:1梯度洗脱，收集甲醇：水体积比为9:1部分洗脱液，旋蒸浓缩获得组分A；4）用1倍体积的氯仿溶解组分A，过200
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300目硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯体积比为30:1开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比为10:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得浸膏，再过200
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300目硅胶柱，以石油醚：氯仿体积比为8:1开始梯度洗脱，收集石油醚:氯仿体积比为4:1部分洗脱液，再过200
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300目硅胶柱层析，以石油醚：乙酸乙酯体积比为20:1开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比为5:1部分洗脱液，旋蒸得到白色粉末状A'
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【专利技术属性】
技术研发人员：邱君志，朱志强，谭震，杨晨杰，陈金慧，刘森，陈宇熹，蒲慧丽，任冠儒，赵杰，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：