生物样本中硫化氢的检测方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种生物样本中硫化氢的检测方法及其应用，涉及硫化氢检测的技术领域。该检测方法包括对样本进行前处理，使样本中的硫化氢反应生成亚甲基蓝，然后采用LC

【技术实现步骤摘要】
生物样本中硫化氢的检测方法及其应用


[0001]本专利技术涉及硫化氢检测
，尤其是涉及一种生物样本中硫化氢的检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]硫化氢(hydrogen sulfide，硫化氢)是一种无机化合物，是一种无色的水溶性气体，并且有臭鸡蛋的味道。硫化氢是继一氧化氮NO和一氧化碳CO之后的第三种重要的内源性气体信号分子，硫化氢参与很多生理病理过程，现在已经有相关研究发现硫化氢在心血管系统，神经系统，消化系统，内分泌系统以及免疫系统等系统中有较为广泛的分布，参与许多生理和疾病的病理生理过程。有文献报道，硫化氢与骨代谢以及骨质疏松等骨疾病中也参与了重要的调控作用，硫化氢有望成为骨代谢以及骨相关疾病研究的新靶点，但是现在缺乏较为准确的方法来测量血清中硫化氢的含量。
[0003]目前，国内外硫化氢常用的检测方法有气相色谱法；电极法以及亚甲基蓝分光光度法。至今为止，气相色谱的方法优点是检测血清硫化氢含量的金标准，虽然气相色谱的敏感性高，特异性好，但是气象色谱的方法缺点是对于检测器，标准气和取样的技术都有较高的要求，气象色谱设备的要求较高，并且检测仪器较为昂贵，检测的时间也比较长，所以一般不作为临床与科研实验的推广。而电极法是通过强碱对样品的蛋白质结构进行破坏，然后通过检测S2‑
而实现样品中硫化氢的含量，但是电极法对于样品量的需求量大，重复性也不太好，所以也没有将电极法广泛推广。亚甲基蓝分光光度法操作标记简单，所需要的试剂相对低廉，所用的检测时间也比较短，所需仪器也比较常见，但是分光光度法的敏感性较差，只有超过10μmol/L的硫化氢才能够利用分光光度计的方法被检测的到。因此，如何改进内源性硫化氢的检测方法，以提高硫化氢检测的准确度和灵敏度，是目前有待解决的问题。
[0004]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一目的在于提供一种生物样本中硫化氢的检测方法，该方法具有检测速度快且准确度和灵敏度高的优点，缓解了现有技术存在的内源性硫化氢的检测方法准确度和灵敏度不足的技术问题。
[0006]本专利技术的第二目的在于提供一种上述生物样本中硫化氢的检测方法在制备用于治疗骨相关疾病的药品中的应用。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术特采用如下技术方案：
[0008]根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种生物样本中硫化氢的检测方法，所述检测方法包括对样本进行前处理，使样本中的硫化氢反应生成亚甲基蓝，然后采用LC
‑
MS检测样本中的亚甲基蓝，将LC
‑
MS检测获得的亚甲基蓝检测值带入标准曲线中，计算得到亚甲基蓝对应的硫化氢的含量；
[0009]所述前处理包括使用提取试剂与样本中的硫化氢反应，得到含有硫化锌的沉淀，
然后在酸性介质中和三价铁离子存在的条件下，与N,N
‑
二甲基对苯二胺反应，生成亚甲基蓝；
[0010]所述提取试剂为氢氧化锌悬浊液。
[0011]优选地，所述氢氧化锌悬浊液为乙酸锌溶液和氢氧化钠溶液混合后得到的悬浊液；
[0012]优选地，乙酸锌溶液的浓度为1～2％w/v；氢氧化钠溶液的浓度为1～2M；乙酸锌溶液和氢氧化钠溶液的体积比为(5～10):1；
[0013]优选地，乙酸锌溶液的浓度为1％w/v；氢氧化钠溶液的浓度为1.5M；乙酸锌溶液和氢氧化钠溶液的体积比为7:1。
[0014]优选地，所述反应试剂为三氯化铁反应液和二甲基对苯二胺反应液混合得到的混合体系，且所述混合体系的使用方式为现用现混合；
[0015]优选地，三氯化铁反应液中三氯化铁的浓度为20～50mM，溶剂为浓盐酸和水的混合体系，其中水和浓盐酸的体积比为(8～10):1；
[0016]优选地，三氯化铁反应液中三氯化铁的浓度为30mM，溶剂为浓盐酸和水的混合体系，其中水和浓盐酸的体积比为9:1；
[0017]优选地，N,N
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二甲基对苯二胺反应液中N,N
‑
二甲基对苯二胺的浓度为15～25mM，其中水和浓盐酸的体积比为4:(5～8)。
[0018]优选地，N,N
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二甲基对苯二胺反应液中N,N
‑
二甲基对苯二胺的浓度为20mM，其中水和浓盐酸的体积比为4:6。
[0019]优选地，所述标准曲线按照如下方法构建：用于构建标准曲线的标准品为包括具有系列浓度的硫化钠标准曲线工作液，将各浓度的硫化钠标准曲线工作液分别与所述反应试剂反应生成亚甲基蓝，然后使用LC
‑
MS检测硫化钠标准曲线工作液中的亚甲基蓝，得到检测值；然后构建亚甲基蓝检测值与对应的硫化钠标准曲线工作液中硫化钠的浓度的对应关系作为标准曲线；
[0020]优选地，所述硫化钠标准曲线工作液中硫化钠的浓度分布范围为0.78μM～100μM；
[0021]优选地，所述标准曲线以硫化钠标准曲线工作液中硫化钠的浓度为自变量，以亚甲基蓝响应峰面积为因变量，构建标准曲线。
[0022]优选地，所述硫化钠标准曲线工作液中的基质为保护液，所述保护液为含有金属螯合剂的碱性溶液；
[0023]优选地，所述金属螯合剂选自EDTA；
[0024]优选地，所述保护液为含有50μM EDTA和200mM氢氧化钠的水溶液。
[0025]优选地，液相色谱色谱柱采用氨基色谱柱，优选采用Waters ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱；
[0026]优选地，柱温为35～45℃，优选为40℃；
[0027]优选地，检测环境温度为不超过20℃，优选为4℃；
[0028]优选地，进样体积为1～2μL，优选为1μL。
[0029]优选地，液相色谱采用梯度洗脱程序，流动相A和流动相B按照体积比，梯度洗脱程序为：
[0030]0.00min，流动相A 5％，流动相B 95％；
[0031]1.50min，流动相A 5％，流动相B 95％；
[0032]4.00min，流动相A 50％，流动相B 50％；
[0033]6.00min，流动相A 50％，流动相B 50％；
[0034]4.50min，流动相A 5％，流动相B 95％；
[0035]10.00min，流动相A 5％，流动相B 95％；
[0036]其中，流动相A为水相，流动相B为有机相；流动相中还含有甲酸和甲酸铵；
[0037]优选地，所述流动相A为含0.1％v/v甲酸和5mM甲酸铵的水溶液；
[0038]优选地，所述流动相B为90％v/v乙腈水溶液，还含有0.1％v/v甲酸和5mM甲酸铵。
[0039]优选地，所述质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；正离子检测模式；三重四极杆分析器；扫描方式为多反应监测模式；
[0040]鞘气温度：300℃；鞘气流速：6L/min；干燥气温度：350℃；干燥气流速10L/min本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物样本中硫化氢的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括对样本进行前处理，使样本中的硫化氢反应生成亚甲基蓝，然后采用LC
‑
MS检测样本中的亚甲基蓝，将LC
‑
MS检测获得的亚甲基蓝检测值带入标准曲线中，计算得到亚甲基蓝对应的硫化氢的含量；所述前处理包括使用提取试剂与样本中的硫化氢反应，得到含有硫化锌的沉淀，然后在酸性介质中和三价铁离子存在的条件下，与N,N
‑
二甲基对苯二胺反应，生成亚甲基蓝；所述提取试剂为氢氧化锌悬浊液。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述氢氧化锌悬浊液为乙酸锌溶液和氢氧化钠溶液混合后得到的悬浊液；优选地，乙酸锌溶液的浓度为1～2％w/v；氢氧化钠溶液的浓度为1～2M；乙酸锌溶液和氢氧化钠溶液的体积比为(5～10):1；优选地，乙酸锌溶液的浓度为1％w/v；氢氧化钠溶液的浓度为1.5M；乙酸锌溶液和氢氧化钠溶液的体积比为7:1。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述反应试剂为三氯化铁反应液和二甲基对苯二胺反应液混合得到的混合体系，且所述混合体系的使用方式为现用现混合；优选地，三氯化铁反应液中三氯化铁的浓度为20～50mM，溶剂为浓盐酸和水的混合体系，其中水和浓盐酸的体积比为(8～10):1；优选地，三氯化铁反应液中三氯化铁的浓度为30mM，溶剂为浓盐酸和水的混合体系，其中水和浓盐酸的体积比为9:1；优选地，N,N
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二甲基对苯二胺反应液中N,N
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二甲基对苯二胺的浓度为15～25mM，其中水和浓盐酸的体积比为4:(5～8)；优选地，N,N
‑
二甲基对苯二胺反应液中N,N
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二甲基对苯二胺的浓度为20mM，其中水和浓盐酸的体积比为4:6。4.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于，所述前处理包括：调节样本pH为9以上，再加入所述提取试剂混合均匀并超声，固液分离后留取沉淀并将沉淀复溶，再在酸性介质中和三价铁离子存在的条件下，与N,N
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二甲基对苯二胺反应，生成亚甲基蓝。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述标准曲线按照如下方法构建：用于构建标准曲线的标准品为包括具有系列浓度的硫化钠标准曲线工作液，将各浓度的硫化钠标准曲线工作液分别与所述反应试剂反应生成亚甲基蓝，然后使用LC
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MS检测硫化钠标准曲线工作液中的亚甲基蓝，得到检测值；然后构建亚甲基蓝检测值与对应的硫化钠标准...

【专利技术属性】
技术研发人员：李春艳，吴俊，张延斌，赵一冉，罗瑜，
申请(专利权)人：北京积水潭医院，
类型：发明
国别省市：